Diapositive 1

1
Electrophorèse capillaire notions fondamentales
Contact Yannis FRANCOIS, Lab. de Dynamique et
Structure Moléculaire par Spectrométrie de Masse,
institut de Chimie, 1 rue Blaise Pascal, 67000
Strasbourg email yfrancois_at_unistra.fr
2
UN PEU DHISTOIRE
1937
Séparation de protéines dans le sérum humain
daprès J.L. Veuthey, Univ. de Genève
3
ET LA SUITE
1939
Séparation de protéines par électrophorèse sur
papier
1954
1967
S. Hjerten capillaires de 300 µm i.d.
1981
J. Jorgenson capillaires de 75 µm i.d.
daprès J.L. Veuthey, Univ. de Genève
4
Une grande famille
Electrophorèse
Electrophorèse de zone
Focalisation isoélectrique
Isotachophorèse
Papier
Gel
Capillaire
CEC
MEKC
CGE
CZE
5
Plan du cours
1. La migration en électrophorèse capillaire 1.1
Mobilité électrophorétique 1.2 Phénomène
délectroosmose 2. La séparation en
électrophorèse capillaire 2.1 Efficacité 2.2
Résolution 3. Lamélioration de la
sélectivité 4. Lanalyse quantitative 4.1
Injection 4.2 Détection 4.3 Mesure des surfaces
de pics
6
Une technique séparative
HPLC
CE
soluté
E
soluté
phase mobile
phase stationnaire
Pas de phase stationnaire
? instrumentation pas de pompe, pas de vanne
dinjection ?MINIATURISATION faibles volumes
déchantillon, délectrolyte ?COÛT EFFICACITE
de séparation élevée
? faible SENSIBILITE DE DETECTION
7
Introduction électrophorèse capillaire
Principe
-

Injection
Détecteur
Générateur de tension
8
Dispositif expérimental
capillaire
-
détecteur

électrodes de platine
réservoirs délectrolyte
générateur haute tension
Capillaires conventionnels silice longueur
20 - 100 cm diamètre interne 20 - 100
µm Différences de potentiel 10 - 40 kV
9
Electrophorèse

ANODE
FF 6 ? ? r vep
FF force de frottement

• viscosité du milieu
• r rayon ionique
• vep vitesse de lion

FE q E
FE force électrique
-
q charge de lion E champ électrique
CATHODE
q
q E
µep
Vep
6 ? ? r
6 ? ? r
10
-




11
-




12
-




13
-




14
-




15
-




16
-




LELECTROPHORESE peut donc séparer ? des
molécules portant des CHARGES DIFFERENTES, ? des
molécules portant des CHARGES IDENTIQUES
mais de TAILLES DIFFERENTES.
17
Electroosmose
Neutralisation par les ions de signe opposé de
lélectrolyte

Surface du capillaire chargée
DOUBLE COUCHE
Origine du phénomène orientation des molécules
différente ? à linterface solide/liquide ions
adsorbés à la surface ? au sein de la solution
ions distribués en fonction des charges
électriques et de lagitation thermique
?déplacement du solvant qui a lieu sous leffet
de lapplication du champ électrique
18
DOUBLE COUCHE le modèle de STERN
19
Flux électroosmotique
La chute de potentiel dans la double couche
détermine la vitesse de déplacement du solvant
? ?
? ? E
µeo
Veo
4 ? ?
4 ? ?
? potentiel zéta ? constante diélectrique
du milieu ? viscosité de la solution
Ordre de grandeur de 0,1 à 1cm.s-1 pour des
champs de lordre de 1500V.cm-1.
20
BILAN
µapp µeo µep
? capillaire de silice
-

- - - - - - - - - - - - - - - - -
-
?eo
21
Mesure des mobilités
Ld
Lt
t0
t
t0Ld/veoLd/(µeo.E) Ld.Lt/µeo.V
tLd/vappLd/(µapp.E) Ld.Lt/(µeoµep).V
22
Efficacité de la séparation
Elargissement de bande selon le modèle de Van
Deemter
sexprime en termes de hauteur équivalente à un
plateau théorique (H)
x
x
H A B/u C.u
Chemins préférentiels (A)
Diffusion moléculaire (B)
fonction à la fois du soluté et de la phase
mobile 
Transfert de masse (C)
influencé par le coefficient de partage et donc
la solubilité relative du soluté dans la phase
stationnaire
23
Profils découlement
HPLC
FLUX HYDRODYNAMIQUE profil parabolique
POMPE
CE
FLUX ELECTROOSMOTIQUE profil plat
-

EFFICACITE ELEVEE
24
Influence du pH sur la paroi du capillaire
Capillaire de silice pI ? 2
Comment jouer sur le paramètre µeo
25
Modification de la surface interne du capillaire
Greffages dynamiques ?Présence dadditifs
dans lélectrolyte Greffages permanents ?Greffag
e chimique 1- activation de la silice par un
réactif de silanisation 2- greffage par des
groupements fonctionnels ?Immobilisation
thermique
26
Amino quenchers surfactants
CTAB
C18 C16 C14 C12 concentration (M) pour ? 0
8.10-6 7.10-5 5.10-4 2,5.10-3
Effet de la longueur de la chaîne hydrocarbonée
sur le potentiel ? du quartz en présence de
solutions dacétate dalkylammonium
27
Amino quenchers polymères polycationiques
polybrene










28
BILAN
µapp µeo µep
? surface chargée positivement
-

?eo
?eo
?ep
?eo
?ep
-
?eo
29
Greffages permanents
- Par liaison covalente
Silylation
?-GPTMS
Silylation et polymérisation
MAPS
Acrylamide
Alcool polyvinylique (PVA)
- Par immobilisation thermique
Hydroxypropylméthylcellulose (HPMC)
Insolubles dans les solutions aqueuses après
chauffage
30
Modifier la surface, COMMENT ?
Rapid Commun. in Mass Spectrom., 1997, 11, 307
31
Facteurs de séparation
1
2
t
déplacement k µep
sélectivité ? k1/k2 ? µep,1/µep,2
? - 1
k 
1
?µep
1
résolution
Rs
Rs
?N
?N
µep,moy µeo
4
?
k 1
4
32
Efficacité de la séparation
Variance de la zone migratrice (loi de diffusion
dEinstein) ?2 ?2 2Dmt proportionnelle à la
longueur parcourue et à la hauteur équivalente à
un plateau théorique ?2 H.L
(µep µeo)V
Vitesse de migration
v
L
Temps de transit du soluté à travers le
capillaire
33
Optimisation de la séparation
avec
V
?µep
µep,moy - µeo
34
AMELIORER LA SELECTIVITE
Composition de lélectrolyte
MEKC
EKC cyclodextrines,
Solvants non-aqueux
SELECTIVITE
Electrochromatographie (CEC)
PAGE
35
Facteurs affectant la mobilité électroosmotique
? ?
? ?
?
µeo
?
4 ? ?

• Composition de lélectrolyte nature et
  concentration des ions,
• pH, solvants organiques
• Nature du capillaire
• ? Température

36
Facteurs affectant la mobilité électrophorétique
q
µep
6 ? ? r
? pH modification de lintensité de la charge
portée par les espèces
? composition ionique de lélectrolyte
influence sur les interactions entre les
groupements ionisables des solutés et les ions de
lélectrolyte (Na, Ca2, Mg2, Cl-, PO43-, )
? ajout de modificateur organique
? température
37
Influence du pH sur la paroi du capillaire µeo
Capillaire de silice
augmentation de ?
38
Notions de pKA
LH ? H L-
39
Tampons couramment utilisés en électrophorèse
capillaire
Solution tampon pKA Phosphate 2.12 -
7.21 -12.32 Citrate 3.06 - 4.74 -
5.40 Formate 3.75 Succinate 4.19 -
5.57 Acétate 4.74 Borate 9.24 Tampons
zwitterioniques MES 6.15 HEPES
7.55 TRIS 8.30
Conductivité faible
40
Influence de la force ionique
? ?
? ?
?
µeo
?
4 ? ?
? densité de charge à la surface du
capillaire ? viscosité de la solution ?
épaisseur de la double couche
? K.(?T/?Cizi2)1/2
41
Influence de la force ionique
? K.(?T/?Cizi2)1/2
lorsquon augmente la concentration de
lélectrolyte ? diminution de ?
Tech. Prot. Chem. II, 3-19 (1991).
42
Influence du modificateur organique
Polaires (? gt30)
Apolaires (? lt30)
Protiques
Protiques
Aprotiques
Aprotiques
ACN DMF DMSO
Eau MeOH
EtOH PrOH
THF Dioxane
? Influence la mobilité et/ou les constantes de
dissociation (pKA, paires dions,)
43
Influence du modificateur organique
q
µep
? Influence sur la viscosité
6 ? ? r
? Influence sur le pH
? Influence sur la solvatation
Solvant Cations Anions Eau Méthanol /-
Ethanol - Acétonitrile - - - -
44
Influence du modificateur organique
? ?
? ?
?
µeo
?
4 ? ?
? Influence sur la viscosité
? Influence sur le potentiel zéta
Solvants polaires (ex eau) potentiels ? qui
peuvent atteindre 100mV. Solvants apolaires (ex
heptane) pas de potentiel ?, sauf en présence
dadditifs.
Augmentation du pourcentage de modificateur
organique ? diminution de ? ACN lt acétone
lt MeOH lt EtOH, PrOH lt DMSO
acétone
ACN
DMSO
45
Règles générales
On a DIMINUTION de la mobilité électroosmotique
? lorsqu'on diminue le pH ? diminution de
? ? lorsquon augmente la concentration de
lélectrolyte ? diminution de ? ? lorsquon
augmente le pourcentage de modificateur organique
? diminution de ? ACN lt acétone lt MeOH lt
EtOH, PrOH lt DMSO
46
AMELIORER LA SELECTIVITE
Composition de lélectrolyte
MEKC
EKC cyclodextrines,
Solvants non-aqueux
SELECTIVITE
Electrochromatographie (CEC)
PAGE
47
Intérêt des milieux non-aqueux

• faibles courants
• ?augmentation des diamètres des capillaires
• ? semi-préparative
• ? augmentation de lefficacité (N/t ??/?2)

? modification des sélectivités ? meilleure
compatibilité avec la spectrométrie de masse ?
augmentation des solubilités (ex cyclodextrines)
48
NACE
Chromatographia, 2000, 52, 403-407
49
NACE
Séparation dun mélange de 12 composés capillaire
de silice 585cm x 50µm i.d. - 30kV électrolyte
(A) éthanol/acétonitrile/acide acétique
(50491) dans 20mM CH3COO-, NH4 (B)
méthanol/acétonitrile/acide acétique (50491)
dans 20mM CH3COO-, NH4
1 amphétamine, 2 éphédrine, 3 levorphanol, 4
dextromoramide, 5 morphine, 6 hydrochlorothiazide,
7 acide benzoïque, 8 acide meso-2,3-diphénylsucci
nique, 9 probenecid, 10 chlorothiazide, 11 acide
phénylènediacétique, 12 acide éthacrynique.
J. Chromatogr. A, 1997, 792, 13-35.
50
AMELIORER LA SELECTIVITE
Composition de lélectrolyte
MEKC
EKC cyclodextrines,
Solvants non-aqueux
SELECTIVITE
Electrochromatographie (CEC)
PAGE
51
Chromatographie électrocinétique
technique séparative qui allie des phénomènes
de type ? électroosmose ? électrophorèse ?
chromatographie
52
Séparation de molécules neutres
? Mobilité non affectée par la présence dun
champ électrique ? Co-élution de toutes ces
molécules avec le flux électroosmotique
Stratégies 1. Formation de complexes chargés ex
composés faiblement hydrophiles en présence de
tetrahexylammonium (THA) S THA
S(THA) S(THA) THA
S(THA)22 ex catéchols en présence dacide
borique 2. Micelles ioniques ?le plus couramment
utilisé
53
Chromatographie électrocinétique micellaire
? assez solubles dans lélectrolyte pour former
des micelles ? transparents à lUV ? micelles
homogènes ? micelles de faible viscosité
Surfactant CMC(10 -3 M) à 25C dans
l eau Sodium dodecylsulfate (SDS) 8.1 Sodium
tetradecylsulfate (STS) 2.1 (50C) Sodium
N-lauroyl-N-methyltaurate (LMT) 8.7 Sodium
cholate 13-15 Cetyltrimethylammonium bromide
(CTAB) 0.92
54
Chromatographie électrocinétique micellaire
55
Chromatographie électrocinétique micellaire
-

- - - - - - - - - - - - - - - - -
-
vep,mc
veo
vep,mc
vep,mc
composé neutre à séparer
micelle
56
injection
détection
micelle libre
soluté
eau
soluté
micelle libre
eau
temps de migration
t0
tR
tmc
t0lt tR lt tmc ? Fenêtre de détection
57
Chromatographie électrocinétique micellaire
58
Pseudo-phases utilisées en MEKC
59
AMELIORER LA SELECTIVITE
Composition de lélectrolyte
MEKC
EKC cyclodextrines,
Solvants non-aqueux
SELECTIVITE
PAGE
Electrochromatographie (CEC)
60
Lélectrochromatographie

• technique séparative qui allie des phénomènes
  de type
• ? électroosmose
• ? électrophorèse
• chromatographie

61
Lélectrochromatographie
62
Comparaison LC/CEC
63
Comparaison HPLC/ CE
CE
HPLC
Volumes de colonne classiques
4 mL 2 µL
Volumes dinjection classiques
1-10 µL 1-10 nL
Limites de détection
10-7-10-8 M 10-5-10-6 M
64
Lélectrochromatographie
65
Comparaison HPLC et CEC
66
Séparation en CEC de composés anioniques de
mobilités voisines
67
AMELIORER LA SELECTIVITE
Composition de lélectrolyte
MEKC
EKC cyclodextrines,
Solvants non-aqueux
SELECTIVITE
PAGE
Electrochromatographie (CEC)
68
Electrophorèse en gel de polyacrylamide
technique séparative qui allie des phénomènes
de type ? électroosmose ? électrophorèse
69
Electrophorèse en gel de polyacrylamide
70
Electrophorèse en gel de polyacrylamide
71
Electrophorèse en gel de polyacrylamide
72
Caractéristique des gels permanents et non
permanents
73
Plan du cours
1. La migration en électrophorèse capillaire 1.1
Mobilité électrophorétique 1.2 Phénomène
délectroosmose 2. La séparation en
électrophorèse capillaire 2.1 Efficacité 2.2
Résolution 3. Lamélioration de la
sélectivité 4. Lanalyse quantitative 4.1
Injection 4.2 Détection 4.3 Mesure des surfaces
de pics
74
INJECTION
Modes dinjection les plus courants par
injection directe dans le capillaire ? injection
hydrodynamique ? injection électrocinétique
La quantité d échantillon injectée Q est définie
comme suit
avec l, la longueur de la zone échantillon r, le
rayon du capillaire C, la concentration du soluté
75
Injection hydrodynamique
par différence de pression, réalisé en appliquant
aux extrémités du capillaire une différence de
pression ?Po
La longueur l du segment injecté est
proportionnelle au temps dinjection tinj, Le
volume déchantillon injecté
76
Injection électrocinétique
ou injection par électromigration
réalisée en plaçant une extrémité du capillaire
dans la solution-échantillon et en appliquant une
différence de potentiel.
l tinj (veo vep)
(?eo ?ep)V.?r2.C.tinj Qinj L
La mobilité électrophorétique intervenant dans
léquation, la quantité injectée sera différente
pour tous les composés du mélange. Léquation
nest valable que si la conductivité de
léchantillon et celle du tampon sont
identiques. Ce mode dinjection est
particulièrement utile en électrophorèse
capillaire sur gel.
77
Plan du cours
1. La migration en électrophorèse capillaire 1.1
Mobilité électrophorétique 1.2 Phénomène
délectroosmose 2. La séparation en
électrophorèse capillaire 2.1 Efficacité 2.2
Résolution 3. Lamélioration de la
sélectivité 4. Lanalyse quantitative 4.1
Injection 4.2 Détection 4.3 Mesure des surfaces
de pics
78
DETECTION
LES PLUS COURANTS ? détection UV ? détection par
fluorescence ? détection par spectrométrie de
masse
Détection OFF-COLONNE
Détection ON-COLONNE
79
ON-COLONNE MODE DIRECT
Détection directement sur le capillaire, à
proximité dune des extrémités ? opérée à travers
une fenêtre réalisée par enlèvement de la gaine
protectrice du capillaire.
? Détection UV
? nécessite lutilisation de capillaires
transparents jusquà 170nm si possible
équipe la plupart de appareils commerciaux ?sensib
ilité limitée à cause de la faible capacité de
chargement des capillaires et de leur faible
diamètre ? 10-5 mol.L-1 ex phénol, LOD 67
fmol ? développement de capillaires à bulle, en
Z pour augmenter le trajet optique
80
ON-COLONNE MODE DIRECT
Détection directement sur le capillaire, à
proximité dune des extrémités ? opérée à travers
une fenêtre réalisée par enlèvement de la gaine
protectrice du capillaire.
? Détection par fluorescence
? généralement bien adaptée aux capillaires de
silice fondue qui présentent une faible
luminescence
généralement réalisée par dérivatisation
préalable des solutés ? dérivés
dansyl/fluorescein-thiocarbamyl des acides
aminés ? fluorescamine pour les acides aminés,
les peptides ex ?-chymotrypsinogène, LOD 2
fmol domaine dynamique linéaire 10-3 - 10-7 M
CE-LIF commercialisée avec un laser argon à 488nm
81
OFF-COLONNE
? Détection par spectrométrie de masse
? nécessite de concevoir une interface adaptée
? assurer le maintien du champ électrique ?
diminuer les effets daspiration ? utiliser des
analyseurs permettant des scans rapides
Interface basée sur le mode ESI/MS appliquée aux
sels dammonium, amines, dipeptides ex pour les
ions simples, LOD 10 amol
82
Méthode LDD (mol) LDD (M) Avantages/
inconvénients UV- Vis 10-13 - 10-16 10-5 -
10-8 Universel Possibilité
dinformation spectrale Fluorescence 10-15 -
10-17 10-7 - 10-9 Sensible
Requiert souvent une dérivatisation
Fluorescence induite 10-18 - 10-20 10-14 -
10-16 Extrêmement sensible par laser
Requiert souvent une dérivatisation
Cher Ampérométrie 10-18 - 10-19 10-10 - 10-11
Sensible Sélective mais seulement pour
analytes electroactifs
Requiert une électronique spéciale et
des modifications du capillaire Conductivité 10-1
5 - 10-16 10-7 - 10-8 Universel
Requiert une électronique spéciale et
des modifications du capillaire Spectrométrie 10-
16 - 10-17 10-8 - 10-9 Sensible de
masse Informations structurales Détection
indirecte 10 - 100 moins quen direct
Universel (UV, fluorescence, ampérométrie)
Plus faible sensibilité quen direct
83
Optimisation de la sensibilité

• Détection par absorbance indirecte
• 2. Préconcentration en ligne avant séparation
• 3. Isotachophorèse (ITP)

84
ON-COLONNE MODE INDIRECT
Déplacement dune substance ionique (co-ion) du
tampon par lion à analyser
Co-ion Charge de même signe que les
analytes Mobilité voisine de celle des
analytes Absorbance forte Concentration ne doit
pas induire une absorbance hors du domaine de
linéarité du détecteur
85
ON-COLONNE MODE INDIRECT
86
Préconcentration en ligne avant séparation
électrocinétique
87
Préconcentration en ligne avant séparation
électrocinétique
88
Préconcentration en ligne extraction phase
solide
89
Préconcentration en ligne extraction phase
solide
90
Préconcentration en ligne extraction phase
solide, application
91
Préconcentration en ligne extraction phase
solide, application
92
Préconcentration en ligne amplification du
champ électrique
93
Préconcentration en ligne amplification du
champ électrique
94
LIsotachophorèse (ITP)

• Intégration dune phase transitoire
  disotachophorèse (tITP)

• Préconcentration des analytes dans un gradient
  de conductivité

BGE
Meneur
Echantillon

• Lélectrolyte support est un électrolyte
  terminal (HCOOH)
• Léchantillon contient un ion meneur (NH4)

95
LIsotachophorèse (ITP)
A
B
Capillaire silice fondue 60 cm x 75 µm d.i. (10
cm au détecteur) avec greffage dynamique HPC
Voltage - 25 kV Température 25C
Détection UV à 200 nm Electrolyte acide
formique 50 mM, pH 2,7 Echantillon digeste
de BSA 20 pmol/µL
A Echantillon avec plug de meneur, Volume
dinjection 10 du capillaire B Echantillon
sans plug de meneur, Volume dinjection 10 du
capillaire
96
LIsotachophorèse (ITP)
97
Plan du cours
1. La migration en électrophorèse capillaire 1.1
Mobilité électrophorétique 1.2 Phénomène
délectroosmose 2. La séparation en
électrophorèse capillaire 2.1 Efficacité 2.2
Résolution 3. Lamélioration de la
sélectivité 4. Lanalyse quantitative 4.1
Injection 4.2 Détection 4.3 Mesure des surfaces
de pics 4. La Focalisation isoélectrique (CIEF)
98
CIEF
99
CIEF