Diapositive 1

1
A
Alignement de toutes les seq prot ZmaSR1 avec les
peptides Ac notés
B (Grand prélèvement choix des lapins pour
purification)
Se6712
se6713
famille
ECL
Mbr
Se6714
se6715
ASR1
C (sérum purifié condition Western blot)
famille
PBS
TBS
10 - 20 - 40µg prot
caséine
lait
caséine
lait
ASR1
PBS
TBS
10 - 20 - 40µg prot
caséine
lait
caséine
lait
OU
Ac peptide lapin sérum gel tp blocage Qté prot Dil sérum Tps révélation bilan

Figure 1. Vérification de la spécificité des
anticorps à différentes étapes de la production
(figure ou tableau)
2
A
B
C
Figure 2. Vérification des anticorps anti-ZmASR1
et anti-famille ZmASR sur des extraits protéique.
Les protéines solubles (150µg) de la feuille de
lépi de la lignée MBS847 ont été séparées par
EBD puis analysées par Western blot à laide des
anticorps anti-famille ZmASR EP37 (A, 1/5000),
anti-famille ZmASR EP38 (B, 1/10000) et
anti-ZmASR1 EP39 (C, 1/20000). Le temps
dexposition des films ECL est de 30 min.
Lensemble des protéines présentes sur la
membrane ont été révélées par une coloration à
largent colloïdal. Une analyse MS des spots
protéique piqués sur des gels colorés au bleu ont
permis didentifier la protéine ZmASR1 (flèches
rouge) et dautres protéines ne correspondant pas
à des protéines ZmASR (flèches bleu et vertes).
3
A
B
C
Figure 3. Immunoprécipitation de la protéine
ZmASR1 grâce à lanticorps anti-ZmASR1. Les
extraits protéiques ont été incubés avec un
anticorps. Après élimination de lanticorps, les
protéines purifiées ont été séparée sur gel
SDS-PAGE puis analysée par Western blot avec
anti-ZmASR1 (panel supérieur). Lensemble des
protéines purifiées ont été révélées par
coloration de la membrane à largent collïdal
(panel inférieur). (A-B) Mise en place du
protocole grâce à la protéine recombinante ZmASR1
(200ng) avec lanticorps anti-ZmASR1 EP39 et le
sérum pré-immun Se6715-PPi selon les protocoles
dAdemtech ou de C.L. avec une incubation de
lanticorps avec la protéine recombinante pendant
1h à température ambiante (A) ou une nuit à 4C
(B). (C) Immunoprécipitation dun extrait
protéique natif de la feuille 5 de la lignée
MBS817 (300µg) avec les anticorps anti-ZmASR1
EP39 et sérume pré-immun Se6715-PPi selon le
protocole de C.L. avec une incubation pendant une
nuit à 4C. Les signes et correspondent à la
présence ou absence des composés lors des essais.
M marqueur de poids moléculaire (kDa).
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A
B
Figure 4. Détermination des conditions optimales
de production des protéines GST-ZmASR1 et ZmASR1.
Des bactéries dE. coli ont été transformées par
un vecteur dexpression inductible contenant
lADNc du gène ZmASR1 de la lignée MBS847 avec
une étiquette GST placée en amont. La production
de la protéine recombinante a été induite par
addition dIPTG (1 mM) durant la phase
exponentielle de croissance de la culture
bactérienne à une température de 20C ou de 30C.
Les extraits protéiques bruts ont été ensuite
purifiés en condition native , soit par
compétition avec une solution de glutathion
réduit pour lobtention de la protéine GST-ZmASR1
(A), soit par clivage enzymatique de létiquette
GST sur colonne pour lobtention de la protéine
ZmASR1 (B). Les protéines recombinante (1µg) ont
été séparées par SDS-PAGE et révélée par Western
blot à laide de lanticorps anti-ZmASR1. La
révélation a été faite par contact du film sur la
membrane (panel supérieur). Lensemble des
protéines présentes sur la membranes ont été
révélées par une coloration à largent colloïdal
(panel inférieur). M marqueur de poids
moléculaire (kDa).
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Figure 5. Mise en évidence de phosphorylation in
vitro chez la protéine ZmASR1. La protéine
recombinante ZmASR1 (5 à 10µg) a été incubée à
30C dans un milieu reconstitué de
phosphorylation à laide ?-32PATP en présence
ou en absence des protéines kinases PKA (5U),
OST1 active (OST1 2.5µg) ou inactive (S175A) ou
VEGF-R1 (200ng), pendant 60 (PKA) ou 240 min
(OST1 et VEGF-R1). Les protéines ont été séparées
par SDS-PAGE, visualisées par PhosphoImager
(protéines phosphorylées, panel supérieur), puis
révélées par coloration au bleu de Coomassie
(protéines totales, panel inférieure. M
marqueur de poids moléculaire (kDa).
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C
A
B
D
E
F
Figure 6. Identification par LC-MS/MS des sites
phosphorylés in vitro de la protéine ZmASR1. La
protéine ZmASR1 a été incubée pendant 240 min
(A-D) ou un temps variable (E) à 30C dans un
milieu reconstitué de phosphorylation en présence
de la protéine OST1 active (A-B, E) ou de la
protéine VEGF-R1 (C-D). Les protéines ont été
ensuite séparées par SDS-PAGE, puis révélées par
coloration au bleu de coomassie. La protéine
ZmASR1 a enfin été piquée et analysée par
LC-MS/MS. (A) Spectre MS2 montrant la perte de
lacide phosphorique après fragmentation pour le
peptide chargé IEEEVAAAAAVGpSGGFAFHEHHEK. (B)
Spectre MS3 confirmant le site phosphorylé. (C)
Spectre MS2 pour le peptide QHLGEAGAIAAGAFALpYEK.
(D) Spectre MS2 pour le peptide
QHLGEAGAIAAGAFALYEK non phosphorylé confirmant la
phosphorylation. Le rectangle bleu correspond au
résidu phosphorylé. Pour lensemble des spectres,
les couleurs correspondent aux types d'ions (b en
rouge et y en bleu) et leur taille est lié à
leur intensité. (E) Cinétique du rapport des
peptides phosphorylés sur les peptides
non-phosphorylés (OP/OH) pour les deux sites de
phosphorylation identifiés sur la protéine
recombinante ZmASR1 par la protéine OST1 après
normalisation avec la valeur maximale obtenue
après 240 min dincubation. (F) Les sites de
phosphorylation identifiés sur la protéine ZmASR1
recombinante comprenant les résidus GST (en gris)
restant après clivage enzymatique, sont
représentés en rouge. Les sites prédits de
phosphorylation sont représentés par des
rectangles gris.
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Figure 7. Mise en évidence de la protéine ZmASR1
dans des extraits foliaires enrichis en
phosphoprotéines. Les protéines solubles (4mg) de
la feuille 4 de la lignée MBS847 cultivée en
condition témoin (Tm) et de déficit hydrique
(Stressé St) ont été enrichies en
phosphoprotéines à laide dune colonne
daffinité Pro-Q Diamond. La fraction enrichie
(100µg) et la fraction non-retenue sur la colonne
(300µg) ont été séparées par EBD et analysées par
Western blot à laide de lanticorps ZmASR1 EP39.
Le temps dexposition des films ECL est de
10min. Les membranes ont ensuite été colorées à
lor colloïdal pour une révélation de lensemble
des protéines présentes. La protéine ZmASR1
présente un décalage au niveau du pI entre la
fraction enrichie-St (flèche rouge) et les autres
fractions (flèche noire).
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A
B
C
Figure 8. Enrichissement en phosphopeptides
dextraits protéiques foliaires. Les protéines
solubles de la feuille 4 et 5 (F4 et F5) de la
lignée MBS847 en condition témoin (Tm) et de
déficit hydrique (St) ont été enrichies en
phosphopeptides sur résine Fe3-IMAC puis
analysées par LC-MS/MS. (A) Répartition des 857
sites phosphorylés identifiés selon le type
déchantillon. (B) Répartition des 667 fonctions
protéiques phosphorylées identifiées selon le
type déchantillon. (C) Distribution des 667
fonctions protéiques identifiés selon la gene
ontology (GO). Grâce au logiciel Blast2Go, une
recherche de similarité par blastX
(e-vlauelt1E-10) a été effectuée contre la base
non-redondante (nr) du NCBI et des annotations du
second niveau de la catégorie fonction
moléculaire ont été assignée pour chaque
interrogation.