Detection Technology for Genetically Modified Crops for Human Consumption

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Técnicas de Biotecnología Métodos de detección,
identificación y cuantificación de moléculas en
Recombinación de ADN
2
Objetivo

• Conocer las diversas técnicas para detección,
  identificación y cuantificación de
• ADN,
• RNA y
• Proteínas

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Determinación de la presencia de organismos
modificados genéticamente (OGM)

• Colecta de las muestras a analizar
• OGM
• Homogeneización de las muestras.
• Liberación de los componentes celulares por
  lisis.
• Adición de amortiguadores específicos para el
  aislamiento de ADN, de ARN o de proteínas.
• Separar las moléculas de muestras complejas.
• Evitar la degradación de las moléculas.

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Determinación de la presencia de organismos
modificados genéticamente (OGM)

• Detección de ADN, de ARN o de proteínas
  transgénicas
• ADN.
• Amplificación por PCR de secuencias blanco.
• Detección por Southern blot de secuencias blanco.
  
• ARN.
• Amplificación por RT-PCR de secuencias blanco.
• Detección por Northern blot de secuencias blanco.
  
• Proteínas.
• Western Blot
• ELISA.
• Identificación y cuantificación de la molécula
  detectada.
• Interpretación y reporte de resultados.

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Aspectos de la Cuantificación

• Muestreo y preparación de la muestra
• El procedimiento determina la representatividad
  del resultado
• Evaluar el tamaño de la muestra, su homogeneidad
  y el umbral
• Deben cumplirse requerimientos estadísticos
• Las matrices requeridas dependerán del tipo de
  material

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Métodos de análisis basados en la detección de
proteínas

• Los transgenes codifican proteínas nuevas
• Las técnicas inmunológicas utilizan anticuerpos
• Ideales para necesidades cualitativas y
  cuantitativas
• Detectan proteínas específicas en matrices
  complejas
• El analito debe ser conocido
• Puede haber interferencia por interacciones no
  específicas con otras proteínas, con sulfactantes
  (saponinas), con fenoles, con ácidos grasos y con
  fosfatasas
• 2.1 Anticuerpos policlonales
• El reconocimiento es muy sensitivo pero es menos
  específico
• 2.2 Anticuerpos monoclonales
• El reconocimiento es altamente específico, pero
  es menos sensible

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La técnica de Western Blot

• Prueba cualitativa altamente específica
• Puede determinar si hay niveles por debajo o
  superiores al umbral mínimo de OGM (0.8 5).
• Es utilizada principalmente en investigación
• Usar electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE
• Solubiliza y remueve agregados y proteínas
  adventicias

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La Electroforesis

• El principio de la electroforesis de proteínas
  (intactas) se basa en su carga neta y en su
  habilidad para migrar dentro de una matriz
  gelatinosa (poliacrilamida proteínas o agarosa
  ADN o RNA).
• Se aplica una corriente eléctrica a la mezcla de
  proteínas por un período de tiempo hasta que las
  proteínas migren y se separan o fraccionen con
  base en su tamaño.

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SDS - PAGE
10
Glu
Asp
Ala
Gln
Phe
Lys
11
Al final, las proteínas quedan separadas por su
tamaño
Escalera de masas moleculares
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La técnica de Western Blot

1. Las proteínas fraccionadas en el gel son entonces
   transferidas a una soporte sólido (nitrocelulosa
   o PVDF)

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La técnica de Western Blot

1. Bloquear el soporte (con leche descremada)

Enjuagar con H2O bidestilada
Adicionar anticuerpos primarios
Enjuagar nuevamente
Los anticuerpos se unirán a proteínas específicas
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1. Adicionar anticuerpos secundarios, dirigidos
   contra los anticuerpos primarios y unidos a una
   enzima

1. Revelar la reacción para desarrollar el color

Deben apreciarse bandas teñidas con el color de
la reacción revelada por la enzima unida al
anticuerpo secundario
15
La técnica de Western Blot
Anticuerpo primario (dirigido contra una
proteína específica)
Anticuerpo secundario (dirigido contra el
anticuerpo primario)
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Ensayo de ELISA en microplaca (Enzyme-Linked
Immuno Sorbent Assay)
El ensayo se desarrolla en microplacas cubiertas
con anticuerpos. Es un ensayo cuantitativo,
altamente sensible, económico, permite el manejo
de muestras múltiples e ideal para análisis de
laboratorio Se requiere que la proteína esté
desnaturalizada
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Ac secundario marcado dirigido contra el Ac
primario
Anticuerpo primario, específico para el antígeno
pozo
Proteína bloqueadora
Antígeno
Respuesta colorida, dependiente de la
concentración de OGM
Placa de ELISA
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Ensayo de tira de flujo lateral
Muestra
Línea de prueba
Línea control
Proteína Bt
Barra 1 Anticuerpo anti Bt
Barra 3 Anticuerpo no específico
Barra 2 Anticuerpo anti Bt
Marcado No fijo
No marcado Fijo
No marcado Fijo
Ahmed, 2002
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Ensayo de tira de flujo lateral
Línea control

• Es una variante del método de ELISA, los
  anticuerpos inmovilizados, específicos para las
  proteínas GM son acoplados a un reactivo colorido
  e incorporados en tiritas de nitrocelulosa.
• Es rápido, económico, portátil y bueno para
  ensayos iniciales.

Línea de prueba
Resultado negativo
Resultado positivo
Ahmed, 2002
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Métodos basados en el ADN

• Se basa en la complementariedad de las hebras del
  ADN, que hibridan en una manera dependiente de la
  secuencia
• El ADN transgénico posee diversos elementos
  únicos en los cultivos

CaMV
Agrobacterium tumefaciens

• Los elementos típicamente presentes en el ADN
  transgénico son una secuencia promotora (35S),
  un gen estructural y una señal de terminación de
  la transcripción (NOS)

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Componentes básicos de genes transferidos

• El ADN transferido por métodos biotecnológicos
  consiste básicamente en tres componentes.
• Una secuencia que regula la transcripción del
  gen codificante (promotor).
• El gen codificante.
• Una secuencia que marca el fin de la
  transcripción.

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ADN, preparación de la muestra

• Requerimientos para la extracción de ADN
• La muestra de laboratorio debe ser representativa
  de la muestra del campo o de la muestra
  alimentaria
• Tener entre 100 y 350 mg
• Debe tener una alta calidad
• El tamaño completo y libre de daños en la
  secuencia
• Efectos adversos por el calor, bajo pH,
  nucleasas, despurinización, degradación
  enzimática, etc.
• ADN de alta pureza
• Se afecta por contaminación de las matrices
  alimentarias
• Polisacáridos, lípidos, polifenoles y químicos de
  la extracción del ADN

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Requerimientos para la extracción de ADN

• Ruptura de las paredes celulares
• Con hielo seco o con nitrógeno líquido
• Desintegración de las membranas celulares
• Con detergentes como el CTAB o el SDS
• Inactivación de nucleasas
• Adicionar EDTA (une Mg2) y proteasas
• Separación de polisacáridos inhibitorios
• Separación de componentes celulares hidrofóbicos
• E.g.. Lípido y polifenoles
• Separación del ADN del detergente, por medio de
  precipitación con alcohol

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Southern Blot
La técnica de la hibridación del DNA, o Southern
blot, se basa en el hecho de que dos cadenas
complementarias se alinearán y formarán un
híbrido.

• Comienza con el corte del ADN GM por medio de
  enzimas de restricción.
• El DNA cortado se fracciona por electroforesis en
  un gel de agarosa.
• El DNA fraccionado se transfiere a un soporte
  sólido.
• El DNA fraccionado se hibrida en el soporte con
  una sonda marcada.
• Radiactividad.
• Digoxigenina.
• La membrana hibridada se expone a una película

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1. Corte del DNA con enzimas de restricción.

Las enzimas de restricción cortan al DNA en
sitios específicos, de tal manera que se generan
segmentos de DNA de tamaños definidos
26

1. El DNA cortado se fracciona por electroforesis en
   un gel de agarosa.

Herbert Boyer inventó una técnica para fragmentar
al DNA, la electroforesis en gel. En esta
técnica, se aplica corriente eléctrica en los
extremos de un gel en donde se han depositado
muestras de DNA, de tal manera que las moléculas
de DNA cargadas negativamente se desplazan hacia
el electrodo positivo (ánodo) y pueden separarse
en función de su tamaño.
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• El DNA cortado se fraccionado se transfiere a un
  soporte sólido.
• Por capilaridad.
• Por aplicación de corriente eléctrica

28

1. El DNA fraccionado se hibrida en el soporte con
   una sonda marcada
2. La membrana hibridada se expone a una película.

Sonda marcada con fósforo radiactivo a-32PdCTP
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Principios de la PCR

• Permite la amplificación exponencial de una
  secuencia blanco de ADN.
• La ADN polimerasa hace copias exactas del
  templado.
• Se requieren cebadores sintéticos que
• Se localizan en los bordes de la secuencia
  deseada.
• Son complementarios a la secuencia del ADN
  transgénico.
• El número de copias de la secuencia blanco crece
  exponencialmente.
• En teoría

30
Construcción Génica
P
T
Gen codificante de una nueva característica
31
Las secuencias blanco para la detección por PCR
de secuencias de ADN de OGM en plantas, tienen el
siguiente orden de especificidades 1 baja
especificidad 4 evento específico de la
transformación
32
Confirmación de la identidad del ADN que se ha
sintetizado por medio de PCR
33

• Verificación del tamaño por electroforesis en gel
  de agarosa.

Problema Artefactos del mismo tamaño darían
lugar a falsos positivos.
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• Verificación del tamaño por medio de ensayos de
  Southern Blot.

Problema Ensayo apropiado pero un poco tardado.
Transferencia de los fragmentos de restricción a
un filtro de nylon
Exposición del filtro a una película de rayos X
Hibridación del filtro con la sonda radiactiva
Filtro
Gel
Las bandas visible en la película de rayos X
significan que la sonda hibridó
Fragmentos de DNA. Hay tantos que se ve una sola
banda
La sonda radiactiva hibrida con el DNA
complementario, pero no es visible todavía.
Fragmentos de DNA que ya se transfirieron al
filtro de nylon
35
Verificación del tamaño por medio de PCR anidado,
con un segundo par de cebadores
36
Verificación del tamaño por medio de PCR anidado,
con un segundo par de cebadores
La primera PCR se hace con cebadores externos
(azul)
La segunda PCR se hace con cebadores internos
(rojo)
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• Secuenciación. Es el único método que no da lugar
  a dudas.

GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGGCCGTCCGGA
GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGGCCGTCCGG
GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGGCCGTCCG
GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGGCCGTCC
GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGGCCGTC
GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGGCCGT
GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGGCCG
GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGGCC
GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGGC
GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCGG
GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGCG
GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAGC
GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGAG
GAGGCCTTCGGTTGCTTAGTAAGGA
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PCR en tiempo real (Cuantitativo)

• La amplificación exponencial por PCR se
  incrementa hasta que se alcanza una meseta, esto
  ocurre entre 30 y 40 ciclos.
• Porque se limitan los componentes de la reacción.
• En esas etapas hay una pérdida de la precisión en
  la cuantificación.
• Los ensayos de RT-PCR (para detectar ARN) son
  proporcionales al número de ciclos.
• Durante la fase exponencial del PCR.
• Se determina el número de ciclos en donde el
  producto sea igual en cantidad al producto de la
  muestra OGM.

39
PCR en tiempo real (Cuantitativo)
40
RT-PCR
Métodos basados en el ARN

• El ARN es transcrito a ADN complementario por
  medio de una transcriptasa reversa aislada o
  clonada de un virus como el del HIV.
• Se cuantifica por la presencia de pigmentos, por
  medio de sondas fluorescentes y por la hidrólisis
  de sondas
• Permite diferenciar los artefactos y los
  productos verdaderos.
• Se requiere de una cantidad mínima de ARN como
  sustrato.
• Es independiente del tamaño del genoma y del
  número de copias del gen
• Se necesitan al menos 36 copias para detectar un
  transgen en una muestra OGM.

Brodman et al., 2002
41
Resumen de los Métodos de detección de moléculas
transgénicas
Proteína
ADN
ARN
Ahmed, 2002
42
Ejemplos de métodos publicados para la
determinación de grupos derivados de OGM,
agrupados de acuerdo con su especificidad en
plantas.
Target sequence Reference
Method to detect plant derived DNA Method to detect plant derived DNA
Chloroplast tRNALeu gene (trnL) intron Taberlet al., 1991
Methods to detect specific plant species Methods to detect specific plant species
Corn/maize single copy invertase gene Ehlers al., 1997
Soybean single copy lectin gene Meyer al., 1996
Tomato single copy polygalacturonase gene Busch al., 1999
Screening methods (category 1) Screening methods (category 1)
Cauliflower mosaic virus promoter (P-35S) Pietsch al., 1997
Nopaline synthase terminator (T-Nos) Pietsch al., 1997
Gene specific methods (category 2) Gene specific methods (category 2)
bar (phosphinotricin acetyltransferase) gene Ehlers al., 1997
CryIA(b) gene (synthetic) Ehlers al., 1997 Vaïtilingom al., 1999
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Ejemplos de métodos publicados para la
determinación de grupos derivados de OGM,
agrupados de acuerdo con su especificidad.
Construct specific methods (category 3) Construct specific methods (category 3)
Bt11 maize junction alcohol dehydrogenase 1S intron IVS6 (enhancer) - CryIA(b) gene Matsuoka al., 2001
Bt176 maize junction CDPK (calcium dependent protein-kinase) promoter - synthetic CryIA(b) gene Hupfer al., 1998
GA21 maize OTP (enhancer) - epsps gene (RoundupReady tolerance) Matsuoka al., 2001
Mon810 maize junction P-35S - heat shock protein (hsp) 70 intron I (enhancer) Zimmermann al., 1998
Mon810 maize junction hsp 70 intron - CryIA(b) gene Matsuoka al., 2001
RoundupReady junction P-35S - Petunia hybrida CTP (chloroplast transit peptide) Wurz Willmund, 1997
T25 maize junction pat (phospinotricin acetyltransferase) gene - T-35S Matsuoka al., 2001
Zeneca tomato junction T-Nos - truncated tomato polygalacturonase gene Busch al., 1999
Event specific methods (category 4) Event specific methods (category 4)
Bt11 maize junction host plant genome - integrated recombinant DNA  Zimmermann al., 2000
RoundupReady soybean junction host plant genome - integrated recombinant DNA Berdal Holst-Jensen, in press Taverniers al., in press Terry Harris, in press