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SEMINARIO 4

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SEMINARIO 4 Activaci n del ciclo celular asociada a muerte neuronal iniciada por da o al DNA. C LULAS EN PROLIFERACION: Neuronas postmit ticas terminalmente ... – PowerPoint PPT presentation

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Title: SEMINARIO 4


1
Activación del ciclo celular asociada a muerte
neuronal iniciada por daño al DNA.
  • SEMINARIO 4

2
CÉLULAS EN PROLIFERACION
Daño al DNA
RELACIÓN
Regulación del Ciclo celular
Apoptosis
3
Neuronas postmitóticas terminalmente diferenciadas
  • Neuronas asociadas a activación del Ciclo celular
  • Expresión de proteínas relacionadas con el CC.
  • Inhibición de esas proteínas tenía efectos
    neuroprotectores.
  • Indices mitóticos elevados

Enfermedades neurodegenerativas
Tanto in vivo como in vitro las neuronas
comprometidas a la muerte celular.
Capacidad de replicar su DNA.
APOPTOSIS
DAÑO DNA
4
Neuronas postmitóticas terminalmente diferenciadas
Mayor sensibilidad
DAÑO DNA
Deficiencia en la reparación de DNA
5
Neuronas postmitóticas terminalmente diferenciadas
Daño al DNA
RELACIÓN ??
Regulación del Ciclo celular
Apoptosis
6
HIPOTESIS
La activación del ciclo celular, es un
componente importante de la respuesta al daño de
DNA, en neuronas postmitóticas terminalmente
diferenciadas
APOPTOSIS
Reentrada al CC
Agentes genotoxicos
7
HIPOTESIS
La activación del ciclo celular, es un
componente importante de la respuesta al daño de
DNA, en neuronas postmitóticas terminalmente
diferenciadas
APOPTOSIS
Reentrada al CC
Agentes NO genotoxicos
8
Cultivos de corteza cerebral de embriones de rata
en dia 18 gt 99 de las cëlulas expresaban MAP 2
( especifica de neuronas) y GFAP ( celulas de la
glia)
  • CITOMETRIA DE FLUJO

9
Tiempo de cultivo entre 4 y 8 dias de celulas
en fase S disminuia al 3 ( neuroblastos)
10
  • Etoposido Homocisteina Peptido ß
    amiloide Metrotexate

AGENTES GENOTOXICOS
Estaurosporina Colchicina
AGENTES NO GENOTOXICOS
11
HIPÓTESIS 1
  • DAÑO EN EL DNA INDUCE LA PRODUCCION Y ACTIVACION
    DEL SUPRESOR TUMORAL PROTEINA p53 EN MUCHOS
    TIPOS CELULARES, INCLUIDAS LAS NEURONAS.

12
  • PROTEINA p53 es el producto de un gen supresor
    tumoral que cumple un rol crítico en la respuesta
    celular al daño del ADN , previniendo así la
    perpetuación de las mutaciones u otras anomalías
    cromosómicas en las células hijas.
  • Sus funciones incluyen
  • SENSAR EL ADN DAÑADO
  • CONTROLAR LA PROGRESIÓN DEL CICLO CELULAR
    Y LA APOPTOSIS
  • PARTICIPAR EN LA REPARACIÓN DEL ADN.

13
  • El daño al ADN aumenta la capacidad de p53 de
    activar genes específicos que ayudan a la célula
    a superar el daño. Además p53 estimula la
    producción de enzimas que intervienen en la
    reparación.
  • El ciclo se detiene en G1 y G2 hasta que se
    repara el daño. Si éste es muy extenso, p53
    activa la expresión de genes que conducen a la
    APOPTOSIS.

14
HIPÓTESIS 2
  • DAÑO EN EL ADN ACTIVA EL CICLO CELULAR EN
    NEURONAS, EVIDENCIANDO UN AUMENTO EN LA EXPRESION
    DE Cdc25A.

15
  • Cdc 25A es un bien establecido regulador de la
    progresión G1-S y marcador de entrada en fase S ,
    a través de su interacción con el sistema
    ciclina-CDK.
  • Pertenece a la familia de fosfatasas que incluyen
    3 homólogos en mamíferos Cdc25A, B y C . Se
    expresa en la fase media de G1 e induce la
    entrada en S.

16
EXPRESIÓN de p53 y Cdc 25A en neuronas tratadas
con agentes genotóxicos versus no genotóxicos
  • Expresion de p53 y Cdc25A luego de 14hs de
    tratamiento con Hom, Aß, Sts.
  • P53
  • Cdc25A
  • Colocalización

17
  • RESULTADO
  • FUERTE EXPRESIÓN de p53 y Cdc25A en neuronas
    corticales expuestas a HOMOCISTEÍNA y Aß PERO NO
    A STAUROSPORINA.

18
Se confirmó el aumento de expresión por inmunoblot
  • Se lisaron las células. Las proteínas fueron
    separadas por tamaños por electroforesis en gel
    de poliacrilamida y transferidas a una membrana
    de nitrocelulosa.
  • La membrana se incubó con Anticuerpos primarios
    contra fosfo-p53 , Cdc25A o Actina.
  • Las membranas fueron expuestas a un anticuerpo
    secundario conjugado con peroxidasa . Se
    visualizaron bandas inmunorreactivas por
    quimioluminiscencia.
  • Se hizo un análisis densitométrico de los blots y
    se expreso la intensidad de la señal corregida
    contra los blots de actina como proporción de la
    señal de control.

19
Se confirmó el aumento de expresión de p53 y
Cdc25A por INMUNOBLOT
INMUNOBLOT MOSTRANDO NIVELES DE EXPRESIÓN DE p53
y Cdc25A 1-Control. 2-St a las 7 hs. 3-Hom a las
7 hs. 4-Aß a las 7 hs. 5-St a las 18 hs. 6- Hom
a las 18 hs. 7- Aß a las 18hs.
20
Conclusion
  • LA EXPRESIÓN DE p53 Y Cdc25A EN NEURONAS
    CORTICALES LUEGO DE LA EXPOSICIÓN A HOMOCISTEÍNA
    Y Aß REFLEJA LA RESPUESTA DE LAS NEURONAS AL DAÑO
    DEL ADN Y LA ACTIVACIÓN DEL CICLO CELULAR
    RESPECTIVAMENTE

21
Determinación de reentrada al CC y replicación
del DNA (Fase S)
Cultivos de Neuronas Postmitóticas se expusieron
a
22
Citometría de Flujo
  • Técnica que permite medir la cantidad de DNA en
    forma individual en cada célula.
  • Fundamento Unión al DNA de una sustancia
    fluorescente.
    Medición a través del citómetro de flujo de
    la intensidad de la fluorescencia la cual es
    proporcional a la cantidad de fluorocromo, que a
    su vez, es proporcional a la cantidad de DNA
    presente en la célula.

23
Fluorocromo Propidium iodide (PI)
  • Fluorocromo intercalante del DNA y RNA de doble
    cadena.
  • Para medir sólo DNA se debe utilizar RNAasa.
  • Trabajar con células muertas y fijadas.
  • Excitación en el azul/verde-rojo.

Tinción con PI 10 µg/ml 30 min. en oscuridad
Fijado
RNAasa (100 µg/ml)
Citometría de flujo
24
Ciclo Celular
4n
2n
25
Perfiles típicos de distribución del ciclo
celular en neuronas corticales de ratones en
cultivos Control, con Etopósido y con
Staurosporina
26
  • Incremento significativo de neuronas en fase S
    luego del tratamiento con Metotrexato,
    Homocisteína y Etopósido.
  • Con Staurosporina y Colchicina los valores fueron
    menores que el control.

27
Conclusiones
  • Los agentes genotóxicos inducen Replicación del
    DNA en neuronas postmitóticas.
  • Los agentes apoptóticos no genotóxicos no inducen
    esta reentrada al ciclo celular.
  • Se vió que la supresión de las cdks produce un
    efecto neuroprotectivo posiblemente por
    perturbación de la respuesta al daño al DNA y la
    apoptosis neuronal asociada.

28
Determinación de reentrada al CC y replicación
del DNA (Fase S)
Cultivos de Neuronas Postmitóticas se expusieron
a
29
Citometría de Flujo
  • Técnica que permite medir la cantidad de DNA en
    forma individual en cada célula.
  • Fundamento Unión al DNA de una sustancia
    fluorescente.
    Medición a través del citómetro de flujo de
    la intensidad de la fluorescencia la cual es
    proporcional a la cantidad de fluorocromo, que a
    su vez, es proporcional a la cantidad de DNA
    presente en la célula.

30
Fluorocromo Propidium iodide (PI)
  • Fluorocromo intercalante del DNA y RNA de doble
    cadena.
  • Para medir sólo DNA se debe utilizar RNAasa.
  • Trabajar con células muertas y fijadas.
  • Excitación en el azul/verde-rojo.

Fijado
RNAasa (100 µg/ml)
Tinción con PI 10 µg/ml 30 min. en oscuridad
Citometría de flujo
31
EXPERIMENTO Nº2
OBJETIVO Relacionar la inducción a la progresión
del ciclo celular con el daño en el ADN y la
muerte celular MATERIALES Y MÉTODOS Cultivos de
células neuronales corticales entre el día 4 y
8 Agentes genotóxicos Etoposido, homocisteína,
metotrexato, Aß1-42 Agentes no genotóxicos
colchicina, estaurosporina Comet assay
cuantificación del daño del ADN Tinción de
Hoechst cuantificación de la apoptosis
32
(No Transcript)
33
(No Transcript)
34
(No Transcript)
35
RESULTADOS
36
CONCLUSIONES
AGENTES GENOTÓXICOS Homocisteína Metotrexato Aß1-
42 Etoposido
AGENTES NO GENOTOXICOS Colchicina Estaurosporina
Daño al ADN Apoptosis
No daño al ADN Apoptosis
37
CURVAS CINÉTICAS DE LOS AGENTES UTILIZADOS
A- etoposido 1µM B-Estaurosprina 2µM
C-Colchicina 0.5µ
38
En que momento del ciclo ocurre la apoptosis?
  • Cultivo de neuronas
  • Exposición al agente en presencia de BrdU
  • Cosecha
  • Fijación en etanol 70
  • Tinción multicolor

39
Cuantificación simultánea de apoptosis y
replicación
Estrategias
experimentales
  • Apoptosis
  • TUNEL TdT BrdUTP-FLUORESCEÍNA
  • Replicación
  • Exposición a luz UV
  • Ac antiBRdU-PHOENIXRED

40
Cuantificación de apoptosis y replicación Resultad
os de la citometría de flujo
Porcentaje significativo de replicación ligada a
apoptosis
Porcentaje no significativo
41
  • La citometría de flujo provee una estimación
    cuantitativa del DNA en cada neurona, demostrando
    una transición de G1 a S en respuesta al daño por
    genotóxicos.
  • En estos casos la reentrada al ciclo celular y la
    replicación serían un mecanismo crítico que
    conducirían a la apoptosis.

42
Objetivos
  • Definir la cascada involucrado en respuesta al
    daño de DNA en neuronas postmitoticas que resulta
    en la reentrada al CC.
  • Evaluar el de neuronas apoptoticas, de
    neuronas en fase S y daño de DNA en presencia de
    ATM inhibido y ante la intervencion con distintos
    agentes que dañan DNA .

43
ATM
  • ATM Proteína del grupo proteinkinasas PIK3.
  • Las PI3K es una serie de proteínas identificadas
    en varios organismos, las cuales se encuentran
    involucradas en diferentes checkpoints de la
    progresión del ciclo celular, respuesta al daño
    de DNA, en procesos de recombinación y
    mantenimiento de la estabilidad del genoma.

44
  • El daño de DNA activa a la proteinquinasa ATM,
    que fosforila a Chk2, para estimular asi su
    actividad quinasa
  • La Chk2 activada fosforila a la fosfatasa Cdc25A
    y la marca para su poliubiquitinización.
  • ATM fosforila a p53 en un sitio que interfiere
    con su union a Mdm2, aumentando su capacidad de
    activar la transcripción de genes que permitan
    reparar el daño de DNA ( entre otros p21)

45
La supresión de la función de ATM en cultivos de
neuronas corticales previene la apoptopsis y
activación del ciclo celular inducida por
etopósido?
46
La supresion de la función de ATM impide la
reentrada en el CC inducida por etopósido?
47
  • Se sugiere un rol clave de la vía ATM-Chkd2 en
    el control en respuesta al daño de DNA,
    conduciendo a la activación del ciclo celular y
    apoptosis en neuronas postmitóticas.
  • La inhibición de la función de ATM, tiene un
    efecto prtector de la apoptosis inducida por
    etoposido, no siendo asi para staurosporina.

48
Objetivo
  • Evaluar el de neuronas apoptóticas ante la
    intervención con Etop Aß y Sts en ratones KO
    para ATM con respecto a ratones WT.

49
Ratones knockout

Genotipificación por metodología de PCR
50
La apoptosis inducida por etoposido o Aß en
cultivo de neuronas de ratones KO para neuronas
fue significativamente menor comparada con los
cultivos de ratones WT. No existieron
diferencias en la apoptosis entre los ratones WT
y KO ante la intervención con Sts.
51
Objetivo Determinar el rol en procesos
neurodegenerativos de la re-entrada al ciclo
secundaria al daño del DNA, en modelos In vivo
  • Ratón transgénico con sobreexpresión de APP
    (modelo experimental de Alzheimer)
  • En los controles y en los mutantes midieron
  • Concentración APP
  • Presencia 8 oxodG
  • Actividad enzimática mOGG1

52
Las nucleobases y la deoxiribosas son factibles
de oxidación generando distintas lesiones 8 oxodG
8 oxodG se encontró en cerebro postmortem en
humanos con Alzheimer
  • Ogg1
  • Pertenece a la superfamilia de endonucleasas
    III.
  • Tiene función glicosilasa y AP liasa
  • Reconoce 8 oxodG y lo remueve por sistema de
    Reparación por Excisión de Bases (simil a una de
    las enzimas del Sistema GO en E. Coli )

53
(No Transcript)
54
Hallaron relación entre el deposito b Amiloide,
el aumento de bases con daño oxidativo y la
disminución de la eficiencia enzimática en la
remoción de las mismas (Falla en el sistema de
Reparación)
55
Conclusiones
No se duerman que ya terminamos!!!!
56
Conclusiones
  • En células proliferantes, el daño al DNA resulta
    en la activación de mecanismos que detienen el
    ciclo celular en checkpoints específicos para dar
    lugar a la reparación. Sin embargo, si el daño es
    demasiado extenso para ser reparado, se activa la
    apoptosis celular.

57
Conclusiones
  • En células postmitóticas terminalmente
    diferenciadas como las neuronas, el daño al DNA
    induce reentrada al ciclo celular pasando por la
    fase S.
    La reentrada al ciclo celular
    sería un paso indispensable para la activación de
    la maquinaria de reparación del DNA.

58
Conclusiones
  • Otros estudios recientes han demostrado que las
    enzimas involucradas en la reparación del DNA
    tienen mayor actividad en las células en
    proliferación que en las diferenciadas.
  • Nuclear uracil-DNA glycosilase (UNG)
    mOgg1 Ku70

59
Conclusiones
  • La reentrada al ciclo celular en neuronas
    diferenciadas puede contribuir a la apoptosis de
    las células con DNA dañado y no reparado.
  • La reparación del DNA es crítica para el SNC,
    sin embargo, con estos resultados vemos que las
    neuronas son más vulnerables al daño al DNA que
    sus precursores.
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