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Voici un cas réel décrivant la détermination
dune structure de protéine par cristallographie.
La protéine qui nous intéresse est le domaine
de fixation de loestradiol du récepteur des
oestrogènes. Les étapes de ce projet sont
décrites ici La purification de la protéine, la
recherche des conditions de cristallisation, la
collecte des données de diffraction et la
résolution de la structure par remplacement
moléculaire.
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La protéine dorigine humaine est exprimée dans
E. coli sous forme de protéine de fusion avec un
histag du côté N-terminal. Un schéma de
purification est décrit
Profil délution de léchangeuse danions et gel
correspondant
Chromatographie daffinité
Dialyse
Chromatographie échangeuse danions
récepteur
Elimination de la fusion His Essais de
cristallisation
1
2
1. Clivage de la protéine de fusion 2. Récepteur
purifié
récepteur
His6-tx
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Cristallisation Nous avons employé la méthode de
diffusion de vapeur en utilisant la technique de
la goutte suspendue (hanging drop) Les essais
ont été réalisés de la façon suivante 2?l de
solution de protéine ont été mélangés à 2 ?l de
solution du réservoir. Ce mélange a été déposé
sur une lamelle de verre et placé au dessus du
puits contenant la solution du réservoir. Les
essais ont ensuite été placés à une température
constante de 24C. Premier crible Les 50
conditions Crystal Screen I de Hampton Research.
Des aiguilles très fines en plumets ont été
obtenues dans certains essais (A) contenant du
polyéthylène glycol (PEG) comme agent précipitant
une semaine après la création de la goutte.
Deuxième crible Nous avons fait des essais en
testant différents types de PEG comme agent
précipitant et différents sels comme additifs.
Nous avons choisi le PEG 4000 et NaCl car des
aiguilles (B) ont été obtenues. Pour améliorer
ces formes cristallines nous avons varié les
concentrations de PEG 4000 de 10 à 20 et de
NaCl de 10mM à 1M dans le réservoir. Des
plaquettes ont été obtenues (C) après plusieurs
mois et environ 1000 essais. Cristallisation
Des cristaux utilisables pour la diffraction 120
60 60?m3 ont finalement été obtenus (D) en
utilisant le réservoir constitué de PEG 4000
14, NaCl 400mM, Tris 100mM pH 8.0 et une
concentration en protéine dans la goutte de
5mg/ml.
A
B
C
D
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Données cristallographiques
Collecte des données Les cristaux utilisables
pour la diffraction ont été prélevés avec une
boucle (voir cours) et congelés instantanément
dans léthane liquide. Les cristaux congelés ont
été emportés au synchrotron à Grenoble sur la
ligne BM30. Enregistrement Nous avons choisi
de collecter les données en imposant une distance
cristal-détecteur de 180mm. La longueur donde
est fixée à 0.934Å. Chacun des 500 clichés de
diffraction enregistrés correspond à une rotation
du cristal de 0.1 pendant 20 secondes
dexposition aux rayons X. La portion despace
réciproque enregistré correspond donc à 50 au
total (sur les 360 de la sphère dEwald), ce qui
compte tenu du groupe despace peut suffire. En
fait, nous avions une idée précise de la maille
et du groupe despace avant davoir terminé la
collecte des données qui a duré quelques
heures. Voici un des 500 clichés enregistrés
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La maille est déterminée de façon automatique par
le programme de traitement des données qui
propose une liste de mailles probables à partir
de quelques clichés de diffraction. Lutilisateur
choisi parmi les mailles possibles celle qui
saccorde à lensemble des taches de diffraction.
Cette étape permet au programme de mesurer les
intensités Ihkl. Puis, en fonction des
réflexions équivalentes, lutilisateur détermine
les éléments de symétrie existants et le groupe
despace. Voici toutes les mailles proposées
par le programme. Un pourcentage faible signifie
une probabilité forte que la maille soit la
bonne primitive cubic 56.71 58.56
57.50 273.85 90.21 90.19 116.42
129.97 129.97 129.97 90.00
90.00 90.00 I centred cubic 71.51
279.86 279.62 61.14 84.30 96.11 159.69
206.87 206.87 206.87
90.00 90.00 90.00 F centred cubic
75.94 279.86 280.23 292.10 24.56 156.93 155.86
284.06 284.06
284.06 90.00 90.00 90.00 primitive
rhombohedral 3.31 279.62 280.20 273.85 12.60
11.87 12.01
277.89 277.89 277.89 12.16 12.16 12.16
58.03 58.03 827.42
90.00 90.00 120.00 primitive hexagonal
1.77 57.50 61.14 273.85 90.38 89.79 120.94
59.32 59.32
273.85 90.00 90.00 120.00 primitive tetragonal
11.72 58.56 57.50 273.85 90.21 90.19
116.42 58.03
58.03 273.85 90.00 90.00 90.00 I centred
tetragonal 12.08 58.56 57.50 550.71 86.93
86.76 116.42
58.03 58.03 550.71 90.00 90.00 90.00
primitive orthorhombic 11.71 57.50 58.56
273.85 90.19 89.79 63.58
57.50 58.56 273.85 90.00 90.00
90.00 C centred orthorhombic 0.51 61.14
98.65 273.85 89.99 89.62 91.18
61.14 98.65 273.85 90.00
90.00 90.00 I centred orthorhombic 12.07
57.50 58.56 550.71 86.76 93.07 63.58
57.50 58.56 550.71
90.00 90.00 90.00 F centred orthorhombic
2.52 61.14 98.65 550.71 89.86 96.00 91.18
61.14 98.65
550.71 90.00 90.00 90.00 primitive monoclinic
0.15 57.50 273.85 58.56 90.19 116.42
90.21 57.50
273.85 58.56 90.00 116.42 90.00 C centred
monoclinic 0.48 61.14 98.65 273.85 90.01
90.38 91.18
61.14 98.65 273.85 90.00 90.38 90.00
primitive triclinic 0.00 57.50 58.56
273.85 90.19 90.21 116.42 Après avoir essayé
plusieurs mailles possibles, nous avons montré
que celle qui s accordait le mieux aux données
de diffraction était hexagonale. Le résultat du
traitement des données est dans notre cas le
suivant Groupe P6522 ab58.6Å c276.0Å
aß90, ? 120 1 monomère /unité
asymétrique résolution 2.4Å réflexions uniques
11539 espace enregistré (completeness)
87 multiplicité (redundancy) 3.9 R merge 6.6
6
Après traitement des données on obtient une liste
dintensité mesurées Ihkl. Extrait h k l
Ihkl erreur 1 0 12 90773.9 5112.4 1
0 15 75765.5 4259.6 1 0 19 1684.3
224.6 1 0 24 9682.9 572.4 1 0 25
259361 15460 1 0 26 276758 16221 1
0 27 110887 5727 1 0 29 75576.7
6150.9 1 0 30 272094 12942 1 0 31
12378.0 825.0 1 0 32 242833 20165 1
0 34 7087.2 903.7 1 0 35 84939.1
4864.8 1 0 36 74041.6 4138.1 1 0 37
33170.8 1828.0 1 0 38 69195.9 3811.0 1
0 39 226882 17629 1 0 40 109797
8529 1 0 41 21276.9 1752.5 Un programme la
convertit en liste de Fhkl (FOBS) et erreur
associée (sigma). INDE 1 0 12 FOBS
870.2 0.0 SIGMA 30.71 INDE 1 0
15 FOBS 803.2 0.0 SIGMA 28.38
INDE 1 0 19 FOBS 120.4 0.0
SIGMA 8.18 INDE 1 0 24 FOBS
284.8 0.0 SIGMA 9.97 INDE 1 0
25 FOBS 1467.8 0.0 SIGMA 77.64
INDE 1 0 26 FOBS 1504.3 0.0
SIGMA 56.59 INDE 1 0 27 FOBS
943.7 0.0 SIGMA 37.95 INDE 1 0
29 FOBS 785.1 0.0 SIGMA 42.37
INDE 1 0 30 FOBS 1519.5 0.0
SIGMA 58.66 INDE 1 0 31 FOBS
343.4 0.0 SIGMA 14.24 INDE 1 0
32 FOBS 1473.1 0.0 SIGMA 57.65
INDE 1 0 34 FOBS 269.6 0.0
SIGMA 13.72 INDE 1 0 35 FOBS
831.5 0.0 SIGMA 31.07 INDE 1 0
36 FOBS 815.1 0.0 SIGMA 29.88
INDE 1 0 37 FOBS 526.0 0.0
SIGMA 19.28 INDE 1 0 38 FOBS
763.4 0.0 SIGMA 28.10 INDE 1 0
39 FOBS 1389.4 0.0 SIGMA 51.55
INDE 1 0 40 FOBS 950.3 0.0
SIGMA 48.31 INDE 1 0 41 FOBS
413.1 0.0 SIGMA 22.41
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Résolution de la structure Le problème de la
phase est résolu par la méthode du remplacement
moléculaire car la structure de ce domaine avec
dautres ligands est déjà connue. Cette méthode
permet dobtenir une matrice de rotation et de
translation du modèle dans la nouvelle maille
-0.26101 -0.93139 -0.25374
69.94 xout(mod11) 0.31924 0.16478
-0.93324 xin(mod11) 16.58
0.91102 -0.32459 0.25433
17.41
Une fois le modèle orienté dans la maille, des
phases peuvent être déterminées et il est
possible de calculer une carte de densité
électronique en utilisant les Fhkl provenant des
mesures de diffraction. La position du modèle
doit ensuite être affinée pour correspondre au
mieux à la densité électronique (1 mois de
travail)
8
LBD ER alpha
Affinement Résolution 2.4Å R19.8 Rfree
21.1
A la fin de laffinement, les facteurs R (voir
cours) sont de lordre de 20, le diagramme de
Ramachandran est satisfait. La structure est
considérée comme terminée.
hélices alpha
brins beta