Sin ttulo de diapositiva

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VACUNA VIVA ATENUADA CONTRA EL COLERA
2
Desarrollo de la Vacuna viva liofilizada contra
cólera de la cepa atenuada 638
Diseño y conducción de ensayos clínicos
Estudios preclínicos
Estudios de estabilidad
Producción y liberación de lotes de vacunas
Desarrollo Tecnológico
Evaluación en voluntarios sanos
Obtención de una cepa atenuada de Vibrio
cholerae O1 El Tor Ogawa.
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OBTENCIÓN, CARACTERIZACIÓN Y EVALUACIÓN DE CEPAS
VIVAS ATENUADAS DE Vibrio cholerae
Boris L. Rodríguez González, Ph. D. Departamento
de Genética, CNIC.
4
(No Transcript)
5
Racionalidad vacunas vivas de cólera
1. Vacuna contra el cólera El Tor
inexistente. 2. Protección en convalescientes ?
3 años. 3. Toxina colérica requisito para el
cólera gravis. 4. Immunidad antibacteriana
protectora. 5. Inmunidad antitoxina
superflua. 6. Desconocimiento de la combinación
de Ag Protectores. 7. Vacunas muertas EP 60
(exc niños), 2 - 3 dosis.
6
DISEÑO EXPERIMENTAL PARA OBTENER CEPAS DE V.
cholerae DE GENERACIÓN 1
Deleción del profago CTXF
Cepas patógenas de V. cholerae
Estrategia
E.coli SM10?pir (donante 1)
Genes de CTXF
Pases y Selección
Conjugación
V cholerae C7258 El Tor Ogawa V cholerae C6706
El Tor Inaba
7
Remoción de CTX ?. Eventos moleculares
P
C1
C2
S1
C6706 C7258
C678 C674 C728
C671 C673 C723
413 417 81 82 84 87 88
LBPA C67 (1...10)
C72 (1...10)
Kb ? A B C
D E
10 pases en LB
23,1
9,4
6,5
4,3
1000 colonias Amp sensibles 70 LBP
y LBPA
2,3
8
DISEÑO EXPERIMENTAL PARA OBTENER CEPAS DE V.
cholerae DE GENERACIÓN 2
Inserción del gen celA en el gen de la
hemaglutinina proteasa
Cepas de generación 1 de V. cholerae
Estrategia
E.coli SM10?pir (donante 2)
Pases y Selección
Conjugación
Hemaglutinina proteasa
cel A
Cepas de Generación 1
81 y 413
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Obtención de CGM de V. cholerae por
reemplazamiento hap por hapcelA
P
C1
S1
61,4,9,10 63 131...10
631 638 1332 1333
81 413
LBPA 6 (1...10)
13 (1...10)
Kb ? A B D
E
1000 colonias LBP y LBPA
10 pases en LB
23,1
9,4
6,5
4,3
2,3
Amp sensibles 21
No. 4
No. 3
SONDAS
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Niveles de toxina colérica en las cepas
progenitoras y modificadas
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Detección de la hemaglutinina proteasa (Hap) en
las cepas progenitoras y genéticamente modificadas
Ensayo de Western blot
Carriles 1 C7258 2 81 3 631 4
638 5C6706 6413 71333
La detección de Hap fue realizada con una
preparación de anticuerpo policlonal anti-Hap
obtenido en conejo. (Anticuerpo donado por el
Dr. Richard Finkelstein)
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Detección de la actividad celulolítica de las
cepas vacunales de V. cholerae de generación 1 y 2
C
A Western blot con anticuerpos policlonales anti
Cel A obtenidos en conejo Carriles 1(413) 2
(1333), 3 (81) 4 (631 5 (638) B Actividad
celulolítica de las cepas vacunales en geles de
poliacrilamida (geles de Beguin) C Actividad
celulolítica de la cepa 638 en placa petri
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DISEÑO EXPERIMENTAL PARA DETERMINAR LA DOSIS DE
TRABAJO CON LAS CEPAS VACUNALES DE GENERACIÓN 1
Y 2
9 grupos de ratones balb/c lactantes fueron
inoculados con las cepas de V. cholerae que se
indican y a las dosis señaladas
Se deteminó la sobevivencia de los animales en
los grupos y se compararon entre si. Se empleó
el método de log Rank
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Selección de la dosis de trabajo
Conclusión La dosis 105 UFC de C6706 o C7258
100 x dosis letal 100
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DISEÑO EXPERIMENTAL PARA EVALUAR LA VIRULENCIA Y
LA CAPACIDAD DE COLONIZACIÓN DE LAS CEPAS
VACUNALES DE GENERACIÓN 1 Y 2
GRUPOS
Diseño

• Se inoculan los ratones Balb/c lactantes con la
  dosis de trabajo (105 UFC)
• Se divide cada grupo en dos subgrupos

Subgrupo 2 Se determina la capacidad de
colonización del intestino delgado UFC/cm2
Subgrupo 1 Se determina la sobrevivencia
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Virulencia y colonización de las CGM (Dosis 105)
-Panel superior Virulencia. Gráfico de
Kaplan-Meier -Panel inferior Colonización en
intestino delgado
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Efecto de dos formulaciones sobre la viabilidad
de dos cepas liofilizadas
1 Log UFC/mL antes del proceso de
liofilización. 2 Log UFC/mL después del proceso
de liofilización. 3 Formulación compuesta por
lactosa, peptona bacteriológica y sorbitol. 4
Formulación compuesta por leche descremada,
peptona bacteriológica y sorbitol.
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PERDIDA DE VIABILIDAD DE LA CEPA 638 EN DOS
FORMULACIONES Y EN DIFERENTES TIEMPOS
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Anticuerpos Monoclonales y Métodos de Detección
20
PATENTE CONCEDIDA
21
PATENTE CONCEDIDA
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ENSAYOS CLÍNICOS EN VOLUNTARIOS SANOS CON INÓCULO
FRESCO DE LA CEPA ATENUADA 638 DE Vibrio cholerae
Luis García Imías Ph. D. Dirección de Vacunas
Bacterianas. www.finlay.sld.cu lgarcia_at_finlay.edu.
cu Habana, Cuba.
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Objetivo

• Demostrar el potencial de la cepa 638 como cepa
  vacunal contra el cólera.

Diseño

• Voluntarios sanos de 18 a 40 años hospitalizados
  en la Sala de Aislamiento Clínico del IPK.
• Estudios a doble ciego (vacuna-placebo) con 18
  voluntarios por ciclo.
• Una sola dosis administrada por vía oral.
• Dos semanas de seguimiento en la sala de
  aislamiento.
• Tratamiento con antibiótico antes de abandonar la
  sala.

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EVALUACIÓN CLÍNICA DE LA CEPA 638
Estudios de reactogenicidad e inmunogenicidad en
voluntarios
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REACCIONES ADVERSAS LUEGO DE LA INGESTIÓN DE LA
CEPA VACUNAL 638

• Los efectos adversos inducidos por la cepa 638
  fueron leves y de escasa duración.
• Se presentaron 4 casos con diarrea reactogénica
  entre los vacunados (8) y un caso en el grupo
  placebo, en los estudios realizados en Cuba.
• En los estudios realizados en Ecuador no se
  presentó diarrea entre los vacunados mientras
  ocurrió en un voluntario placebo.
• La sintomatología presentada no interfiere con
  las actividades normales del vacunado.
• Tanto en la diarrea como en el resto de los
  síntomas no se encontraron diferencias
  significativas entre el grupo vacunado y el
  placebo.

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RESULTADOS DE INMUNOGENICIDAD
27
Ensayo de eficacia protectora del candidato
vacunal
Dr. Manuel Díaz Jidy Subdirector del Instituto de
Medicina Tropical Pedro Kourí jidy_at_infomed.sld.c
u Habana, Cuba.
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Antecedentes

• Primera vez que se realiza en Cuba.
• Hacerlo directamente en humanos.
• Producir un infección experimental potencialmente
  mortal en voluntarios.
• No existe la enfermedad en el país.

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Objetivos

• Garantizar la salud de los voluntarios
  participantes.
• Valorar la eficacia protectora de la cepa 638.
• Evaluar la reactogenicidad e inmunogenicidad.
• Impedir escape al medio ambiente del producto
  vacunal y/o la cepa viva virulenta con que se
  retó.

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DISEÑO DEL ESTUDIO DE RETO
21
Voluntarios
18 - 40
años
12
voluntarios

9
voluntarios
1-9 x 10
UFC
cepa

Placebo
9
Un

mes

después
Un

mes

después

Cepa
de
reto
3008 10
UFC (12 V and 9 P)
6

Seguimiento síntomas clínicos durante 5 días



EFICACIA PROTECTORA
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Resultados
Incidencia de diarrea después de la
administración de la cepa del reto

• La cepa 638 mostró una eficacia protectora del
  100 .

Grupo 1 (vacunados) N12
Grupo 2 (placebo) N9
7 (77.7 )
0 (0.00 )

• La cepa 638 resultó segura, no reactogénica e
  inmunogénica.
• No se evidenciaron escapes de la vacuna, ni de la
  cepa virulenta al medio ambiente.

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Impacto Científico
Este estudio constituyó la prueba indispensable
para determinar la selección de la cepa atenuada
638 como ingrediente farmacéutico activo dentro
de la vacuna contra el cólera, del serotipo y
biotipo de mayor interés epidemiológico en el
mundo. Estos ensayos prestigian la capacidad de
Cuba en la validación de vacunas y nos permite
continuar investigaciones cada vez más complejas.
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DESARROLLO TECNOLÓGICO FARMACÉUTICO DE LA VACUNA
VIVA ATENUADA CONTRA EL CÓLERA
Lic. Yilian Plasencia Gerencia de Proyectos.
www.finlay.sld.cu yplasencia_at_finlay.edu.cu
Habana, Cuba.
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Desarrollo Farmacéutico
Transferencia de Investigación a Desarrollo

• Desarrollo de una tecnología de obtención a
  escala piloto del preparado vacunal

Medios de cultivo de diferentes proveedores
Microbiología

• Optimización de los parámetros de cultivo

Tiempos de esterilización Velocidades de
agitación Volúmenes de cultivo Aireación
superficial sumergida
Flujos de aire
Fermentación
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Centrifugación

• Selección del método de separación celular

Filtración tangencial
Selección de lioprotectores Parámetros de
liofilización

• Establecimiento de una tecnología de liofilización

• Establecimiento de una tecnología de producción

• Adecuación del área y obtención de la licencia de
  producción del CNSB

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• Producción y liberación de lotes de vacuna

Colonización Inmuogenicidad
Batería de caracterización Ensayos de liberación
de lotes

• Definición del desarrollo analítico (control de
  calidad)

Pureza Identidad Seguridad Viabilidad
Inmunogenicidad Toxicidad
Preclínica Consistencia Estabilidad

• Otros estudios

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• Elaboración de la documentación

• Tramitación de solicitud de autorización para el
  inicio de los ensayos clínicos

Inocuidad frente a Vibrio cholerae Evaluación
capacidad tampón Evaluación de su
disolución Estudio de estabilidad

• Obtención del antiácido

• Confección del protocolo del ensayo clínico
• Diseño y conducción de un ensayo clínico fase I
  II en Cuba

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Vacuna viva atenuada contra cólera
Producto liofilizado. Es una vacuna de células
enteras de Vibrio cholerae que se reconstituye
con un antiácido en 100 mL de agua natural, lista
para su uso inmediato
Forma farmacéutica
Oral
Vía de administración

• Bulbo conteniendo una dosis

• Estuche conteniendo el antiácido

Presentación

• Vaso conteniendo 100mL de agua natural

Dos procesos semanales de 10L, con un rendimiento
de 1192 dosis
Capacidad productiva
39

• Fin