Regolazione dell

1
Regolazione dellEspressione Genica

• Puo essere regolata in una delle seguenti sei
  fasi

inactive mRNA
NUCLEUS
CYTOSOL
degradazione
DNA
mRNA
mRNA
RNA transcript
trascrizione
Maturazione
trasporto
traduzione
protein
controllo dellattivita
inactive protein
2
Metodi per studiare lespressione dei geni

• Northern blot
• Trascrittasi Inversa -PCR (RT-PCR)
• Ibridazione In situ
• Trascrizione In vitro
• DNA Microarray

3
Purificazione dellRNA

• Procedura
• Lisi delle cellule con un reagente che dissocia
  le nucleoproteine e inibisce la RNAsi
• Rimozione delle proteine
• Precipitazione specifica dellRNA

4
Northern blot

• Per determinare la dimensione e la quantita di
  specifici mRNA
• Studi sullespressione genica

5
Northern blot

• Elettroforesi dellRNA in gel contenente
  formaldeide per mantenere lRNA in forma
  completamente lineare
• Trasferimento dellRNA su una membrana
• Ibridazione con una sonda marcata

6
(No Transcript)
7

Gel Elettroforesi- Separa le
molecole in base alla dimensione

8
Trasferimento su supporto solido
9
Trasferimento dal gel alla membrana
10
Dopo il trasferimento
gel
membrana
11
Preparare la sonda per il Northern Blot
12
Ibridazione

• La sonda marcata e aggiunta ad una soluzione
  contenente il supporto solido che lega lRNA da
  analizzare

13
Lavaggio

• Rimozione della sonda non legata al supporto
  solido

14
Rivelazione degli ibridi

• Esposizione di un film se la sonda e marcata
  radioattivamente
• Se la sonda e marcata con un enzima si procede
  alla reazione enzimatica che produce colore
  direttamente sul supporto solido

15
(No Transcript)
16
Northern blot

• La rivelazione avviene usando
• DNA marcato con radioattivo(32P)
• DNA marcato con un enzima che catalizza una
  reazione che produce luce o colore

17
Northern blot
Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae
total RNA from leaves (L), germinating seeds
(Se), roots (Ro) and stems (St). The blot was
hybridized with probes for ElLTP1 (top panel) and
ElLTP2 (middle panel). The bottom panel shows
ethidium bromide staining of the gel before
blotting. The numbers to the left indicate
approximate transcript sizes in kb
18
Svantaggi del Northern Blot

• Richiede grandi quantita di RNA
• E un processo lungo e laborioso

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AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA REAZIONE A
CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
20
PCR reazione polimerasica a catena

• Inventata da Kary Mullis negli anni 80 (premio
  Nobel 1993)
• Serve per ottenere una grande quantita di una
  specifica sequenza di DNA in vitro
• Puo amplificare un tratto di DNA per piu di 1
  milione di volte

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ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE 1- DUE
OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI A DUE REGIONI CHE
SI TROVANO SU FILAMENTI OPPOSTI DEL DNA STAMPO
AI LATI DELLA REGIONE CHE SI VUOLE
AMPLIFICARE 2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA
REGIONE DA AMPLIFICARE 3- POLIMERASI
TERMOSTABILE (NON VIENE DENATURATA SE PORTATA A
95 C) 4- I 4 DESOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATI
22
IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI
CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI 1-
DENATURAZIONE TEMP. 95C. IL DNA STAMPO VIENE
DENATURATO, I DUE FILAMENTI SI SEPARANO
2-APPAIAMENTO 55C CIRCA. I PRIMERS SI
APPAIANO CON IL DNA STAMPO 3- SINTESI TEMP.72C
E OTTIMALE PER IL FUNZIONAMENTO DELLA Taq
(Termus aquaticus) POLIMERASI
23
PCR Reazione a catena della polimerasi
Metodo di amplificazione del DNA usando una
polimerasi termostabile quale la Taq DNA
polimerasi, uno stampo di DNA, un eccesso di
primers e dideossinucleotidi (dNTP) in un buffer.
24
PCR Reazione a catena della polimerasi
25
PCR Reazione a catena della polimerasi
26
PCR amplificazione
n.ro cicli 1 3 10 15 20 25 30
n.ro sequenze bersaglio 0 2 256 8192 262.144 8.388
.608 268.435.456
La sequenza bersaglio è la sequenza di DNA
sintetizzata tra i due primers
Occorre 1?g di DNA per lanalisi di una sequenza
o una digestione con enzimi di restrizione tali
da poter essere visibili in elettroforesi. Se vi
sono 5 pg di DNA/cellula umana (5x10-12g) allora
1 ?g of DNA potrebbe essere isolato da 200.000
cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i
geni. In 1 ? g di DNA genomico, una copia singola
di un gene (300 bp) equivarrebbe a 0.1 pg di
DNA. Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere
amplificato mediante PCR producendo 0.8 ? g in 25
cicli e 27 ? g in 30 cicli.
27
PCR

• VANTAGGI
• Sensibilita
• Rapidita
• Si presta allanalisi simultanea di molti
  campioni (high throughput)
• Si presta allanalisi simultanea di diverse
  sequenze sullo stesso campione
• Si presta allanalisi di DNA degradato o incluso
  in mezzi strani, o fissato
• SVANTAGGI
• Sensibilita (rischio di contaminazioni-falsi
  positivi)
• Variabile efficienza di amplificazione a seconda
  della sequenza
• Richiede conoscenza di base delle sequenze da
  amplificare e messa a punto per coppie di
  oligonucleotidi di innesco (primers)
• Può sintetizzare frammenti relativamente corti
• La sintesi è imprecisa e introduce errori nella
  sequenza (la Taq pol non possiede attività 3-gt5
  esonucleasica)

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Esempi di utilizzo della PCR

• Su DNA
• segnalare la presenza o meno di sequenze
  specifiche (mutazioni, inserzioni virali,
  micro-organismo patogeni) -gt PCR DIAGNOSTICA
• Amplificare frammenti specifici da usare in
  seguito come sonde oppure da clonare

• Su RNA messaggero (RT-PCR)
• segnalare la presenza di specifiche molecole di
  RNA (espressione genica, presenza di RNA di
  micro-organismi infettivi)
• Amplificare frammenti specifici da usare in
  seguito come sonde oppure da clonare - isolare
  cDNA specifici per determinati geni.

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Trascrittasi Inversa-PCR

• Rivelazione di mRNA molto rari
• Analisi di RNA con pochissime quantita

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Procedura

• Purificazione dellRNA
• Aggiungere i primer
• mescolare RNA con la trascrittasi inversa per
  effettuare la sintesi del primo filamento di cDNA
• Aggiungere la DNA polimerasi termostabile per
  effettuare la sintesi del secondo filamento di
  cDNA e per amplificarlo con i cicli della PCR

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Trascrittasi inversa - PCR (RT-PCR)
AAAAA
5
mRNA
3
TTTTT
3
Primer 1
5
reverse transcriptase (RNA-dependent DNA
polymerase)
AAAAA
3
mRNA
5
5
TTTTT
cDNA
3
Remove RNA (RNase A)
TTTTT 5
cDNA
3
Add PCR primers
5
3
Primer 2
TTTTT
5
3
Primer 3
Add Taq polymerase. Run PCR
32
RT-PCR semi-quantitativaSelezione del numero di
cicli necessari per trovarsi nella fase di
amplificazione esponenziale
Number of molecules
Number of cycles
33
RT-PCR in tempo reale

• Utilizza particolari combinazioni di coloranti
  fluorescenti la cui fluorescenza viene
  smascherata quando la catena di DNA viene
  sintetizzata oppure che vengono intercalati nella
  catena nascente durante la reazione di
  amplificazione.
• Lutilizzo di appositi apparecchi permette la
  misurazione della fluorescenza accumulata in
  tempo reale, proporzionale al numero di molecole
  amplificate e quindi al numero di molecole
  presenti in partenza

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Polymerase Chain Reaction resa

• Resa teorica 2n
• P(2)n T Il prodotto (P) incrementa
  esponenzialmente con il numero di cicli di PCR
  (n)
• Il prodotto di PCR dipende da T,numero di
  copie di template di partenza

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Perché Real-Time?

• Misura l'amplificazione in tempo reale durante la
  fase esponenziale della PCR, quando cioè
  l'efficienza di amplificazione è influenzata
  minimamente dalle variabili di reazione,
  permettendo di ottenere risultati molto più
  accurati rispetto alla PCR tradizionale "end
  point"

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RT-PCR quantitativa

• Rilevamento della fluorescenza associata
  allamplificazione
• Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di
  agarosio
• Analisi del prodotto di fluorescenza tramite
  computer

Plot lineare
Incremento di fluorescenza
Cicli di PCR
37
Analisi tramite software
38
Chimiche fluorescenti per PCR Real-Time

• La fluorescenza si genera durante la PCR per
  effetto di diverse possibili reazioni chimiche
• Le chimiche principali sono basate sia sul legame
  di coloranti fluorescenti che si intercalano
  nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green,
  sia sull'ibridazione di sonde specifiche.

39
SYBR Green principio
SYBR Green I
Utilizza una molecola fluorescente non specifica
che si lega al solco minore del DNA
40
Allinizio del processo di amplificazione, la
miscela di reazione contiene DNA denaturato,
primers e la molecola fluorescente
SYBR Green
41
SYBR Green
Dopo lannealing dei primers, si legano poche
molecole fluorescenti alla doppia elica.
42
SYBR Green
Durante lelongazione si verifica un aumento di
fluorescenza che corrisponde all aumento del
numero di copie dellamplicone
43
(No Transcript)
44
Reverse transcriptase-PCR ( RT-PCR)

Epoxide hydrolase

- - - - RT

l se r st l se r st pl
l
2027
1904
1584
947
831
564
45
Ibridazione dellRNA in situ
Rivelazione di mRNA direttamente su tessuti messi
su vetrini da microscopio
Preparation of RNA probe with in vitro
transcription
T7/T3 or SP6 promoter
46
RNA in situ hybridization
Colour substrate nitro blue tetrazolium (NBT)
5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)
Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense
(a-c) and sense (d) RNA probes for ElLTP1. E.
lagascae seedlings were collected 7 days after
sowing. co Cotyledon, en endosperm, hy
hypocotyl, am apical meristem, ro root
47

• Il livello di RNA presente nella cellula non
  necessariamente riflette direttamente i livelli
  di trascrizione del gene
• Per poter asserire che un gene viene attivato
  TRASCRIZIONALMENTE occorre poterne visualizzare
  lattivita

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Il saggio di run-on permette di determinare il
livello di trascrizione di un gene

• Purificare i nuclei
• NTP, 32P GTP
• Trascrizione la catena nascente
• e radioattiva
• Estrazione dellRNA
• Ibridazione a cDNA immobilizzato su filtro

49
Sintesi differenziale di 12 geni codificanti mRNA
epato-specifici analizzata tramite run-on
Lodish Figure 10-23
50
Northern blotting
51
reverse Northern blotting
52
cDNA arrays (continued)

• macro-arrays
• low-density
• filter-supported
• radioactive probes (duplicates)
• low sensitivity
• only cDNA clones spotted
• cheap

53
cDNA arrays (continued)

• micro-arrays
• high-density
• glass-supported
• fluorescent probes (single slide)
• high sensitivity
• ability to spot oligonucleotides
• very expensive

54
I microarrays
Tessuto della prostata, normale
Tessuto della prostata, tumorale
Un microarray è un supporto solido sul quale sono
stati posizionati diverse migliaia di cDNA in
spot separati. Ciascuno spot rappresenta un gene,
in quanto contiene numerose copie di un cDNA
corrispondente a tale gene.
In questo esempio i cDNA sono stati posizionati
su di un vetrino, simile ai normali vetrini usati
per listologia.
55
Microarray technology
Probes
Microarray synthetized by photolithography or
EST/oligo linking
http//www.ym.edu.tw/excellence/HBP/HBP_CP4/proced
ure.htm
56
utilizzo dei microarrays
Tessuto della prostata, normale
Tessuto della prostata, tumorale
si confrontano i profili di espressione genica di
due campioni differenti. E necessario estrarre
le molecole di mRNA dai due campioni.
57
Arrays
58
Targets
59
Hybridisation
60
Data Processing
61
(No Transcript)
62
Spot-finding (1)
63
Confronto dei profili di espressione genica in
due campioni cellulari diversi
Estrazione dellmRNA dai 2 campioni di cellule
che si vogliono confrontare
(1)
(2)
Conversione in cDNA
(6)
Immagine a colori raffigurante il microarray
Marcatura con 2 fluorocromi diversi
(3)
Eccitazione della fluorescenza tramite laser
(4)
(5)
Riconoscimento tra i cDNA
provenienti dai 2 campioni e quelli già presenti
sul microarray
64
STUDIO DEI PROMOTORI siti di legame dei
fattori di trascrizione EMSA
65
Trans Factor Methods EMSA
66
Trans Factor Methods EMSA
Electromobility Shift
67
Trans Factor Methods Consensus Sequence Capture
68
Il saggio EMSA identifica interazioni tra DNA e
proteine
69
Il saggio EMSA identifica interazioni tra DNA e
proteine

• Competizione con stesso sito, sito analogo, sito
  mutato
• Identificazione dei fattori coinvolti tramite
  supershift con anticorpi

Lodish Figure 10-7
70
Il footprint con DNasi I permette di localizzare
il sito di interazione tra proteina e DNA
Lodish Figure 10-6