Separazione di sottoclassi di aggregati di proteine con gradiente di saccarosio

1
Corpi di inclusione
Casati Alessio, Corbetta Monica, Grimoldi Dario,
Vanzin Alessia
2
Sommario

• Conoscenze attuali
• Strutturazione
• Composizione proteica
• Corpi di inclusione e fibrille amiloidi
• Corpi di inclusione come catalizzatori

3

• Introduzione
• I corpi di inclusione sono aggregati di proteine
  insolubili che si formano nei batteri quando
  viene over-espressa una proteina eterologa.
• Tali corpi sono costituiti da proteine non
  foldate o foldate in modo non corretto.
• Lespressione di proteine ricombinanti è un
  fattore di stress perché compete in termini
  energetici con lespressione nativa, interferendo
  col normale metabolismo e formando aggregati
  nelle cellule batteriche.
• Le proteine over espresse, che sfuggono al
  controllo di qualità degli chaperoni e delle
  proteasi, possono essere immagazzinate in corpi
  di inclusione per evitare laccumulo di materiale
  tossico.
• I corpi possono essere riscontrati a livello del
  citoplasma o del periplasma ed essendo strutture
  reversibili possono essere disaggregati o
  solubilizzati fungendo così da riserva di
  proteine sfoldate.
• Il recupero può avvenire in tempi successivi
  quando gli chaperoni sono nuovamente disponibili
  permettendone il corretto folding.

4
Strutturazione dei corpi di inclusione
Tramite microscopia elettronica e modelli
cinetici di digestione con tripsina, si è
osservata uninaspettata architettura dei corpi
di inclusione e la coesistenza di popolazioni
differenti di proteine aggregate, con diversi
stati conformazionali.

• Corpi di inclusione con età differente
  sottoposti a digestione con tripsina manifestano
  velocità differenti di degradazione.
• Dal grafico si nota che corpi di inclusione
  recuperati dopo solo 1 h dallinizio della
  produzione della proteina eterologa sono digeriti
  in pochi minuti, mentre quelli recuperati dopo 24
  h sono digeriti in circa 4 h.

Si deduce che il tempo di degradazione è
proporzionale alletà del corpo di inclusione.
Inoltre, proteine eterologhe diverse possono
formare corpi di inclusione di dimensioni
diverse, che però hanno lo stesso tempo di
degradazione, da ciò si evince che il tempo di
degradazione non dipende dal volume raggiunto ma
piuttosto dalla topologia della superficie.
5
Architettura dei corpi di inclusione

• Larchitettura dei corpi di inclusione è stata
  osservata attraverso microscopia a
• scansione elettronica
• i corpi di inclusione non trattati con tripsina
  rivelano la caratteristica morfologia a croce,
  con superficie liscia (fig. A),
• il trattamento con tripsina genera una profonda
  frammentazione che da origine a subunità sferiche
  e pezzi a forma di croce (fig. B) che poi
  spariscono in seguito ad una prolungata
  incubazione con tripsina.

6
Corpi di inclusione e stabilità proteica

• Considerando le equazioni che descrivono le
  cinetiche di digestione dei corpi di inclusione,
  si deduce che
• Nei corpi di inclusione coesistono specie
  proteiche diverse. Tali proteine hanno diverse
  emivita, dovute alle differenti sensibilità alla
  proteolisi.
• Una medesima proteina può essere presente in
  differenti stati conformazionali, che determinano
  una diversa sensibilità allazione della
  proteasi.
• La rilevante percentuale di proteine altamente
  sensibili e la presenza di profonde linee di
  frammentazione, suggeriscono unattività invasiva
  della tripsina che attacca in modo selettivo
  definiti settori del corpo di inclusione.
• Si deduce che la degradazione non può essere solo
  spiegata attraverso lerosione superficiale, ma
  ci sono fattori più complessi rispetto alla
  singola topologia superficiale che potrebbero
  modulare le dinamiche della digestione.

7
Riepilogando

• In seguito a digestione con tripsina si ottengono
  particelle pseudosferiche resistenti al taglio
  proteolitico. Questa osservazione è in accordo
  con il processo di costruzione dei corpi di
  inclusione che prevede laggregazione di
  polipeptidi intorno ad un core iniziale fino alla
  formazione di un unico corpo di inclusione
  ordinato.

8
Separazione di sottoclassi di aggregati di
proteine su gradiente di saccarosio

• I gradienti di densità vengono da sempre
  utilizzati per separare molecole biologiche in
  funzione della massa.
• Andrea Schroeder e Ario de Marco (2005)
  sviluppano una tecnica analitica addizionale
  basata sullutilizzo di un gradiente di
  saccarosio che consente di separare diverse
  sottoclassi di aggregati che si formano in
  batteri indotti a esprimere la proteina di
  fusione GFP-GST.
• Le frazioni cellulari batteriche sono state
  caricate su un gradiente allo 0, 30, 50, 70,
  80 di saccarosio e sono state isolate quattro
  frazioni di GFP-GST.

9
Lanalisi dimostra che GFP-GST è presente in
tutte le frazioni ma le proteine che
co-migrano con essa (compresi gli chaperoni) sono
specifiche per una particolare frazione.
Distribuzione della proteina ricombinante
utilizzando frazioni cellulari derivate da
differenti ceppi batterici e da batteri cresciuti
a differenti temperature. Il tubo numero 1 è
stato caricato con il supernatante separato dopo
lultracentrifugazione del lisato mentre per gli
esperimenti successivi sono stati utilizzati i
lisati totali.
10
Il dot blot eseguito successivamente utilizzando
gli anticorpi contro i principali chaperoni, ha
dimostrato che DnaK e ClpB sono concentrati
principalmente nelle frazioni con un gradiente
superiore ( in cui si accumula materiale a bassa
densità), mentre GroEL e IbpB co-migrano con
gli aggregati di dimensioni maggiori.

• Tramite un successivo saggio Bradford si è potuta
  determinare la quantità di proteina ricombinante
  presente nelle varie frazioni
• 39 nella frazione 1
• 25 nella frazione 2
• 22 nella frazione 3
• 14 nella frazione 4.

11

• Il gradiente di saccarosio ha mostrato che
  esiste una differente modificazione del pattern
  di aggregazione al variare delle concentrazioni
  della DnaK.
• Nelle frazioni superiori dei mutanti DnaK-,
  non è stata ritrovata la proteina ricombinante e
  nelle frazioni inferiori si sono accumulati
  aggregati non fluorescenti.
• Al contrario sia la proteina GFP-GST che una
  fluorescenza più marcata sono state riscontrate
  in batteri che overesprimono DnaK.
• Questi risultati dimostrano che DnaK è in
  grado di migliorare la stabilità di GFP-GST.

12
Struttura degli aggregati

• In tutte le frazioni, è stato evidenziato un
  legame con la tioflavina T, una molecola in grado
  di legarsi a strutture fibrillari simili ad
  amiloidi. Al contrario lacido 8-anilino-1-naftale
  nsolfonico, solitamente utilizzato come marker
  per aggregati amorfi, sembra non interagire con
  gli aggregati.
• Questa osservazione suggerisce che gli
  aggregati costituiti da GFP-GST non sono un
  complesso caotico di sole interazioni
  idrofobiche, ma possiedono una struttura regolare
  ordinata, probabilmente ricca in beta-sheet.
• Inoltre, si osserva che il legame alla
  tioflavina aumenta passando dalla frazione 1 alla
  4, di conseguenza anche la formazione di
  strutture simili ad amiloidi cresce.

13

• Tramite unanalisi di microscopia elettronica, si
  è potuta confermare lipotesi secondo cui lo
  sviluppo di fibrille è caratterizzato da una fase
  iniziale di aggregazione in cui si ha la
  formazione di piccoli seed, seguita da una fase
  di crescita più rapida che porta alla formazione
  di strutture fibrillari più complesse. Una volta
  costituita lorigine, laggregazione diventa
  sempre più veloce, quindi gli aggregati di
  dimensioni maggiori hanno la possibilità di
  svilupparsi più velocemente in strutture ad alta
  complessità rispetto agli aggregati più piccoli.
• Lanalisi ha evidenziato che
• - nella frazione 1 erano visibili
• aggregazioni di 20-40 nm
• - nella frazione 2 si osservano strutture
• lunghe un centinaio di nm
• - nella 3 e nella 4 si costituiscono fibrille
  
• più lunghe di un micron.
• 
  
  

14

• Similarità tra corpi di inclusione e fibrille
  amiloidi
• Tutti i polipeptidi aggregati in corpi di
  inclusione e in fibrille amiloidi, mostrano le
  medesime caratteristiche
• legano certi coloranti come il congo red e la
  tioflavina T
• hanno morfologie fibrillari simili
• le proteine aggregate si organizzano in una
  struttura cross-b-sheet.
• È quindi possibile pensare a un modello di
  aggregazione simile?
  

La formazione di amiloidi è proposta come un
meccanismo simile alla cristallizzazione, dove la
crescita degli aggregati richiede la formazione
di un nucleo. Dopo la formazione del nucleo, la
conseguente aggiunta di monomeri per la
formazione del polimero diventa energicamente
favorevole e si accresce rapidamente. Questo
modello di aggregazione nucleazione-dipendente è
valido anche per la formazione di IB batterici.
Gli IB si originano dalla crescita di un numero
limitato di aggregati fondatori e questa può
essere una spiegazione plausibile del ridotto
numero di IB (spesso uno solo) formati nel
citoplasma delle cellule.
15

• Non solamente la complessità iniziale, ma anche
  il tempo di incubazione dei polipeptidi inclini
  allaggregazione è un fattore cruciale per la
  formazione degli aggregati.
• Tale ipotesi è stata dimostrata separando la
  proteina ricombinante su gradiente di saccarosio
  e analizzandola 24 ore dopo al microscopio
  elettronico tutte le frazioni mostrano una
  complessità simile che è quindi indipendente
  dallo stato iniziale di aggregazione. Il tempo
  dincubazione fornito è stato sufficiente per
  raggiungere la fase di crescita rapida che porta
  alla formazione di fibrille.

16

• Laggregazione di GFP-GST è attivamente
  supportata?
• Si è in seguito valutato se componenti
  cellulari siano coinvolte nella catalisi della
  formazione di fibrille di GFP-GST. Il processo
  di maturazione dellaggregazione della proteina
  ricombinante è stato limitato a unora e
  successivamente la proteina è stata purificata da
  tutte le altre proteine cellulari. Dopo quattro
  settimane di incubazione, non è stata riscontrata
  alcuna modifica nellaggregazione.

Nel processo di formazione di fibrille regolari
oltre alla proteina ricombinante sono
necessariamente coinvolte altre componenti
cellulari, che probabilmente facilitano la
formazione dei seed iniziali. In particolare un
ruolo rilevante sembra essere quello degli
chaperoni, e soprattutto di GroEL che sembra
attivamente coinvolta nella formazione dei corpi
di inclusione.
17
Complessità degli aggregati e refolding

• Gli aggregati separati nelle frazioni 3 e 4 sono
  stati utilizzati per testare se tali complessi
  possono essere substrato di un refolding
  chaperone-dipendente e per vedere se strutture
  con complessità differente hanno un ruolo nella
  cinetica di refolding.
• Si è potuto osservare che una combinazione
  equimolare di DnaK, DnaJ, GrpE e ClpB disaggrega
  velocemente gli aggregati. La complessità degli
  aggregati della frazione 3 è stata ridotta in
  modo più efficiente ( 4 min) rispetto alla
  frazione 4 (10 min).

La disaggregazione di diverse sottoclassi di
aggregati, preferenziale per quelli a complessità
più bassa, indica che sottoclassi specifiche di
proteine intrappolate in corpi di inclusione,
sono rifoldate in condizioni fisiologiche e che
la reversibilità è dipendente dalla dimensione
degli aggregati.
18
Localizzazione degli chaperoni

• È stato osservato che
• DnaK è localizzata principalmente sulla
  superficie degli aggregati e si trova in basse
  concentrazioni anche nel citoplasma ma non si
  trova mai allinterno dei corpi di inclusione.
• GroEL si trova ad alte concentrazioni nel
  citoplasma ma non è presente nei corpi di
  inclusione.
• Lassenza della DnaK allinterno dei corpi
  di inclusione sembra indicare che tale
  chaperonina non è coinvolta nella formazione dei
  corpi di inclusione. Tuttavia linterazione di
  tale proteina con il corpo di inclusione è
  successiva alla formazione del corpo di
  inclusione stesso dal momento che si trova
  esclusivamente sulla superficie.
• Dalla localizzazione si può quindi evincere
  la funzione delle due chaperonine DnaK e GroEL
  permettono di solubilizzare le proteine del corpo
  di inclusione.

19
Corpi di inclusione come catalizzatori

• Sciogliere e garantire il corretto folding delle
  proteine contenute nei corpi di inclusione è un
  processo lungo e costoso che spesso comporta una
  ingente diminuzione delle resa.
• Perché non usare direttamente i corpi di
  inclusione?
• Saltando i protocolli di disaggregazione e
  re-folding, è possibile immettere i corpi di
  inclusione direttamente nella miscela di
  reazione?

20
Vantaggi

• Possibilità di un downstream più semplice
  (escludendo i protocolli di disaggregazione e
  refolding)
• Recupero diretto dellenzima dalla mix di
  reazione attraverso una centrifugazione a bassa
  velocità

21
tutto questo è possibile se

• i corpi di inclusione contengono proteine attive

22
Confronto attività enzimaticacorpi di
inclusione vs proteine solubilizzate

• ESPERIMENTO
• 1) espressione di una proteina eterologa in un
• opportuno ospite
• 2) recupero i corpi di inclusione ed il 50 di
  questi vengono solubilizzati
• 3) valutazione attività incubando una aliquota
  delle proteine solubilizzate o dei corpi di
  inclusione nella mix di reazione (deidrofolato
  reduttasi e b-galattosidasi)
  valutazione della fluorescenza
  (GFP, BFP)

23
Risultati

• I corpi di inclusione hanno valori di attività e
  fluorescenza positivi!!

24

• Lattività e la fluorescenza dei corpi di
  inclusione è compresa in un range tra il 6 e il
  166 rispetto a quanto avviene per le proteine
  solubilizzate
• QUINDI
• I corpi di inclusione contengono proteine
  moderatamente inattivate, sebbene si riscontra
  una alta di ß-sheet .

25
Come è possibile?!

• Come è noto, corpi di inclusione sono formati da
  proteine non correttamente foldate che espongono
  dei siti idrofobici ed in virtù di tali siti
  interagiscono tra di loro formando grossi
  aggregati.
• MA non è detto che le interazioni tra i siti
  idrofobici impediscano la formazione di un
  corretto folding del sito attivo permettendo così
  lattività enzimatica mostrata negli esperimenti
  condotti sui corpi di inclusione.
• Inoltre la porosità e lidratazione dei corpi di
  inclusione garantiscono una buona diffusione del
  substrato

26
Concludendo

• Lattività enzimatica mostrata dai corpi di
  inclusione varia da proteina a proteina, in ogni
  caso la scelta di utilizzare i corpi di
  inclusione si può rivelare vincente sul mercato
  biotecnologico.
• Tale scelta va ponderata accuratamente in
  funzione del costo di downstream e dellattività
  mostrata dal corpo di inclusione.

27
Bibliografia

• Fine architecture of bacterial inclusion bodies
  (M. Mar Carrio et al., 2000)
• Characterization of the aggregates formed during
  recombinant protein
• expression in bacteria (Andrea Schrodel and Ario
  de Marco, 2005)
• Amyloid-like Properties of Bacterial Inclusion
  Bodies (Mar Carrio et al., 2005)
• Localization of chaperon Dnak and GroEl in
  bacterial Inclusion Bodies
• (M. Mar Carrio and Antonio Villaverde, 2005)
• Protein aggregation as bacterial inclusion bodies
  is reversible (M. Mar Carrio
• and Antonio Villaverde, 2000)
• Aggregation as bacterial inclusion bodies does
  not imply inactivation of
• enzymes and fluorescent proteins (E.
  Garcia-Fruitos et al., 2005)