La Citometra de Flujo en el Diagnstico y Seguimiento de la Hemoglobinuria Paroxstica Nocturna HPN

1
La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y
Seguimiento de la Hemoglobinuria Paroxística
Nocturna (HPN)
III Reunión Anual de la Asociación Valenciana de
Hematología y Hemoterapia Castellón, 27 de
febrero de 2009

• Amparo Sempere
• Servicio de Hematología
• H.U. La Fe

2
HPNDefinición

• Enfermedad clonal adquirida de la célula
  hematopoyética pluripotencial
• Mutación somática en el gen PIG-A
  (fosfatidil-inositol-glucano de clase A)
  implicado en la síntesis de glucosilfosfatidilinos
  itol (GPI)
• Carencia total o parcial de la expresión de
  proteínas ancladas a la membrana a través del
  componente GPI en parte de la células
  hematopoyéticas

3
HPNAlteración genética Gen PIG-A
Bloqueo en la HPN

• Uno de los más de 20 genes implicados en la
  síntesis de las proteínas ancladas a GPI
• Se encuentran mutaciones del gen PIG-A en todos
  los casos en que se ha interrumpido la síntesis
  de GPI
• Como consecuencia de la mutación se reduce o
  falta la expresión de proteínas ancladas a la
  superficie de la célula por moléculas de GPI

PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK
4
HPNProteínas ancladas a GPI

• Enzimas acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina
  granulocítica
• Moléculas de adhesión CD48, CD58, CD66b-c
• Proteínas reguladoras del complemento
• CD55 factor que acelera la degradación de las
  convertasas del complemento (DAF)
• CD59 inhibidor de membrana de la lisis reactiva
  (MIRL)
• Receptores CD14, CD16, CD87, CD90
• Antígenos de grupos sanguíneos eritrocitarios
• Antígenos del neutrófilo
• Otros CD24, CD52

Hernández-Campo et al. Med Clin. 2008 131
617-630
5
Distribución de las proteínas ancladas a GPI
CD55 CD58 CD59 PrPC AChE JMH Ag Dombroch HG Ag
Células B
CD24 CD55 CD58 CD59 CD48 PrPC CD73 CD108
Células progenitoras hematopoyéticas
Hematíes
CD55 CD58 CD59 CD48 CD52 CD87 CD108 PrPc ADP-RT
CD73 CD90 CD109 CD16
Células T
CD55 CD58 CD59 CD109 PrPC GP500 Gova/b
Plaquetas
CD59, CD90, CD109
Células NK
CD55 CD58 CD59 CD14 CD16 CD24 CD48 CD66b CD66c CD
87 CD109 CD157 LAPNB1 PrPC p50-80 GPI-80 ADP-RT NA
1/NA2
Monocitos
CD55 CD58 CD59 CD48 CD52 PrPc CD16
(Cortesía de Lucio Luzzatto) PNH Masters. October
15-17, 2008. Leeds, UK
PMN
CD14 CD55 CD58 CD59 CD48 CD52 CD87 CD109 CD157 G
rupo 8 PrPC GPI-80 CD16
6
Déficit de proteínas GPI hemólisis intravascular

• La reducción o ausencia de CD55 y CD59 en la
  superficie de los eritrocitos los hace muy
  vulnerables a la acción del complemento y provoca
  su destrucción
• CD55 (DAF) previene la formación de complejos
  C3-C5-convertasa esenciales para la amplificación
  de la secuencia de activación de las proteínas
  del sistema de complemento
• CD59 (MIRL) inhibe la formación del complejo de
  proteínas del sistema del complemento C5b-C9 de
  ataque de membrana
• Déficit de CD59 formación de poros en la
  membrana y muerte celular

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HPNCascada del Complemento
Vía alternativa
Vía clásica
CD59
PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK
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HPNTipos de hematíes según sensibilidad al
complemento

• HPN tipo I sensibilidad normal a la acción del
  complemento
• HPN tipo II sensibilidad intermedia (3-5 veces
  superior a la normal). Déficit parcial de CD59
• HPN tipo III sensibilidad elevada (15-25 veces
  superior a la normal). Déficit total de CD59

Rosse WF, Dacie JV. J. Clin Invest 1966, 45
736-748 Rosse WF, Dacie JV. J. Clin Invest 1966,
45 749-757
9
HPNIncidencia y prevalencia

• Enfermedad rara, pero grave
• Incidencia 1,3 casos por 1.000.000 habitantes y
  año
• Prevalencia 7-16 casos por 1.000.000 habitantes
• Afecta igual a hombres y mujeres

Hill A et al. Blood 2006 108 A985
10
HPNHistoria Natural
11
HPNHistoria Natural

• Amplio espectro de manifestaciones clínicas
• Mediana de edad al diagnóstico ? 40 años
• Mortalidad atribuible ? 50 (trombosis y
  citopenias)
• La trombosis es la principal causa de mortalidad
  y de morbilidad
• Mediana de supervivencia 10-25 años
• Remisión espontánea 15

12
HPN Clínica
Trombosis
Anemia aplásica
Hemoglobinuria

• Hemólisis intravascular síntomas 1
• dolor abdominal
• disfagia
• disfunción eréctil
• letargia

• Trombosis2,3
• - hepática, cerebral
• ? 50
• de pacientes

• Insuficiencia medular
• puede preceder a la HPN4,5

1. Rother et al. JAMA 20052931653-627. 2.
Hillmen P, Lewis SM, Bessler M et al. N Engl J
Med 19953331253-8. 3. Socie G, Mary JY,
Gramont A et al. Lancet 1996348573-7. 4. Wang
et al. Blood 20021003897902. 5. Dunn et al.
Ann Int Med 19991314018.
13
HPNClasificación

• HPN clásica hemólisis intravascular, elevado
  de granulocitos deficientes en proteínas GPI y
  una población mayoritaria de hematíes tipo III.
  Sin otra enfermedad medular asociada
• HPN asociada a otras hemopatías hemólisis
  intravascular en el contexto de otra enfermedad
  medular como AA y SMD
• HPN subclínica sin evidencia clínica ni
  analítica de hemólisis. Mediante citometría de
  flujo se detectan pequeños clones de células de
  HPN. Asociación frecuente con insuficiencia
  medular (AA y SMD)

Parker C et al. Blood 20051063699-709
14
HPN sintomática o molecular?

• Mosaicismo células progenitoras normales y
  patológicas
• Enfermos con pequeños clones raramente tendrán
  síntomas relacionados con la HPN
• En pacientes con clones de granulocitos HPN lt 10
  la clínica de hemólisis será mínima o nula (AA y
  anemia refractaria)
• Un clon de granulocitos HPN superior a 50 mayor
  riesgo de trombosis
• El tamaño del clon puede variar con el tiempo y
  un 15 de enfermos con HPN hemolítica pueden
  tener remisión espontánea
• El tratamiento va a depender, en gran medida, de
  la presentación clínica y del tamaño del clon HPN

15
HPNTratamiento

• Sintomático (transfusiones, anticoagulación oral,
  corticoides, ácido fólico, hierro,)
• Trasplante de progenitores hematopoyéticos único
  tratamiento curativo
• Eculizumab (anti-C5) nuevo tratamiento
  específico de la HPN (Registro Internacional de
  HPN)

16
Eculizumab Anticuerpo anti-C5
Human framework regions
CH1

• Hinge

CL
Complementarity determining regions(murine
origin)
CH2
Human IgG4 heavy chain constant regions 2 and 3
Human IgG2 heavy chain constant region 1 and hinge
CH3
Rother et al. Nature Biotech 200725126573
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HPNCascada del Complemento
Vía alternativa
Vía clásica
CD59
PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK
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HPNQuién debería ser estudiado?

• Hemoglobinuria
• Hemólisis intravascular no inmune (Coombs
  negativo, LDH elevada) especialmente si
  ferropenia
• Trombosis de localización infrecuente síndrome
  de Budd-Chiari, venas abdominales, cerebrales o
  dérmicas
• Anemia aplásica
• SMD Anemia refractaria
• Disfagia o dolor abdominal y hemólisis
  intravascular
• Citopenias mantenidas de origen desconocido

Parker C, Omine M, Richards S et al. Blood, 2005
106 3699-709
19
HPNEvaluación inicial

• Estimar el grado de hemólisis hemograma,
  reticulocitos, LDH sérica, bilirrubina
  fraccionada y haptoglobina
• Determinar el grado de insuficiencia medular
  aspirado y biopsia de médula ósea y citogenética
• Establecer el déficit de proteínas asociadas a
  GPI detección de poblaciones de células de
  sangre periférica (hematíes, neutrófilos y
  monocitos) deficientes en antígenos asociados a
  grupos GPI

Parker C, Omine M, Richards S et al. Blood, 2005
106 3699-709
20
HPNMétodos Diagnósticos

• Pruebas clásicas aumento de la sensibilidad de
  los hematíes a la lisis mediada por el
  complemento
• Citometría de flujo (CMF) ausencia de proteínas
  asociadas a grupos GPI
• Análisis molecular secuenciación e
  identificación de mutaciones del gen PIG-A

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HPNPruebas Clásicas

• Pruebas de Ham-Dacie y de sacarosa
• Técnicas laboriosas
• Difícil estandarización
• Restringidas a hematíes
• Falsos negativos (especialmente en pacientes
  transfundidos)
• Requiere un 5 de células tipo III (déficit
  total) o un 20 de tipo II (déficit parcial) para
  dar resultados positivos
• Interés histórico

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Suero fresco acidificado inactivado por calor
Suero fresco acidificado magnesio
Suero fresco
Salino hematíes
Control de sacarosa
Suero fresco acidificado
Sacarosa
PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK
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HPNAnálisis Molecular

• Secuenciación del gen PIG-A
• No aplicable como técnica de rutina
• Laboratorios de investigación

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HPNCitometría de Flujo

• Nicholson-Weller, 1985 aplicación de la CMF al
  diagnóstico de la HPN
• Van der Schoot, 1990 superioridad de la CMF
  sobre la prueba de Ham
• Hall Rose, 1996 CMF como método de elección
• Brodsky, 1999, 2000 método diagnóstico
  alternativo, proaerolisina conjugada con
  fluoresceína (FLAER, de fluorescein-labelled
  AERolysin)

Vidriales M. B. Haematologica (ed. esp.) 2008 93
(Supl.2) 9-11
25
Citometría de FlujoVentajas

• Rapidez (1 hora)
• Sensibilidad (clones lt1)
• Marcaje múltiparamétrico con tres anticuerpos la
  sensibilidad puede llegar a 0,01
• Análisis de diferentes líneas celulares
• Detección de clones de hematíes tipo I/II/III
• Cuantificación y monitorización del tamaño del
  clon HPN

26
HPNCitometría de Flujo

• El análisis por citometría de flujo es el método
  de elección para el diagnóstico y seguimiento de
  la HPN

27
Citometría de FlujoCélulas

• Analizar un mínimo de dos líneas celulares
• Hematíes
• Neutrófilos y monocitos
• Linfocitos discrepancias en el tamaño clonal
  respecto a los neutrófilos
• Plaquetas expresión débil y variable de
  proteínas GPI en controles sanos

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Citometría de Flujo Tamaño del clon HPN

• Tamaño del clon de hematíes
• - Tipos de hematíes I/II/III
• - Proporción de hematíes HPN en relación a
  la última transfusión
• Tamaño del clon de neutrófilos refleja mejor el
  tamaño del clon HPN
• Tamaño del clon de monocitos valida el tamaño
  del clon HPN (puede tener discrepancias con los
  neutrófilos)

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Citometría de FlujoEstudio de hematíes

• Análisis multiparamétrico con marcaje directo
• Adquisición con SSC/FSC en escala logarítmica
• Estudio de dos antígenos GPI diferentes CD55 y
  CD59 (permite descartar deficiencias congénitas
  aisladas)
• Incluir un AcMo frente a un antígeno eritroide no
  asociado a GPI para seleccionar los hematíes
  (CD235a)
• CD59 discrimina hematíes tipo I, II y III
• Las transfusiones afectan el tamaño del clon de
  hematíes (realizar estudio tras un mínimo de un
  mes desde la última transfusión)
• El estudio puede realizarse hasta 2 semanas tras
  la extracción de la muestra (mantener los
  hematíes a 4º C)
• Incubación mínima de 15 min y un solo lavado
• Incluir un control de sangre normal

30
Hematíes análisis multiparamétrico
Combinación CD59 FITC/CD55PE/CD235a PE-Cy5
Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008.
Leeds, UK
31
CD59 Identificación y cuantificación de clones
HPN
PNH
Count
CD59 FITC-A
Tipo I células con expresión normal de CD59 Tipo
II células con deficiencia parcial de CD59 Tipo
III células con deficiencia completa de CD59
PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK
32
HPN clásica hematíes
Control
Control
HPN clásica
HPN clásica
Tipo III
Tipo II
Tipo I
33
HPN CD59 hematíes
lt1
HPN subclínica
HPN AA
12,2
Tipo II
84
Control
HPN clásica
Tipo I
Tipo III
34
Citometría de FlujoEstudio de leucocitos

• El análisis en granulocitos es superior al de
  hematíes para establecer el tamaño del clon HPN
• El estudio debe ser multiparamétrico lo que
  permite detectar de forma simultánea la
  deficiencia de antígenos GPI e identificar clones
  de HPN de pequeño tamaño
• Es muy importante la selección de los AcMo
  contra antígenos GPI (alta expresión en células
  normales, específicos de una línea celular, baja
  afinidad por uniones inespecíficas y combinables
  en un marcaje múltiple)
• Es recomendable utilizar AcMo no asociados a GPI
  para seleccionar la población diana
• La técnica de FLAER permite detectar pequeños
  clones HPN

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Citometría de FlujoNeutrófilos y monocitos

• Sangre periférica en EDTA (lt24 horas)
• Análisis multiparamétrico con marcaje directo
• Neutrófilos CD16, CD24, CD55, CD59 y CD66b
• Monocitos CD14, CD52, CD55, CD59
• Selección de la población CD15, CD33
• Se debe valorar la presencia de formas inmaduras
  y displasia (citología/CMF).
• Adquisición de 100.000 eventos
• Incluir un control normal de forma paralela
• CD55 y CD59 lisar y marcar
• Análisis inicial de neutrófilos y monocitos
  (CD16/CD14), si compatible con HPN analizar
  hematíes

36
Estrategia de análisis neutrófilos y monocitos
P1P3 granulocitos
P2P4 monocitos
Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008.
Leeds, UK
37
Neutrófilos CD16
Control
HPN Subclínica
HPN Clásica
38
Neutrófilos CD55
HPN AA 3,5
Control
HPN clásica 92
39
Neutrófilos CD55
HPN subclínica 1,2
HPN AA 6,5
HPN clásica 92
Control
40
Monocitos CD14
HPN AA 7
Control
HPN clásica 93
41
Monocitos CD55
HPN AA 6
HPN clásica 93
Control
42
Citometría de Flujo FLAER

• La aerolisina es una toxina secretada por la
  Aeromonas hydrophila, que produce hemólisis
  mediante la unión a la molécula GPI
• La proaerosilina es una variante inactiva de la
  proteína bacteriana que está conjugada con
  fluoresceína (FLAER) y que mantiene la capacidad
  de unión a GPI sin causar lisis
• Restringida a leucocitos, permite la
  identificación y cuantificación de pequeños
  clones de HPN (lt0,02)
• Puede utilizarse sola o en combinación con más
  anticuerpos dirigidos frente antígenos GPI
• Permite el análisis de pacientes con SMD

Brodsky RA, et al. Blood 1999 93 1749-1756.
Brodsky RA, et al. Am J Clin Pathol
2000114459466
43
Citometría de Flujo FLAER
Células normales
Células normales
Células HPN
Brodsky RA, et al. Am J Clin Pathol
2000114459466
44
FLAER análisis de los clones
HPN
HPN
Clon de granulocitos HPN 8,9
Clon de monocitos HPN 8,1
FLAER/ CD24 /CD16 /CD33/CD15/CD14
Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008.
Leeds, UK
45
HPNCMF Seguimiento

• El seguimiento y la monitorización del clon de
  HPN es esencial en el manejo clínico del enfermo
• En los enfermos en tratamiento con eculizumab
  aumenta el clon de hematíes y se iguala al de
  neutrófilos en unos 6 meses de media
• Monitorizar el clon de granulocítos es importante
  por el riesgo de trombosis
• En HPN subclínica se recomienda controlar el
  tamaño del clon tras iniciar tratamiento con
  inmunosupresores
• El tamaño del clon puede variar con el tiempo y
  pacientes con un clon de HPN estable y de tamaño
  intermedio peden tener una remisión espontánea

Richards SJ et al. Cytometry 2007 72B 291-298
46
Citometría de Flujo Seguimiento del clon HPN

• Controles mínimos (Registro Internacional de
  HPN)
• Pacientes con HPN clásica sin eculizumab y en HPN
  asociada o subclínica anual
• Enfermos con HPN con eculizumab al inicio del
  tratamiento, a los 6 meses y después anual
• Reevaluación si cambios clínicos

Richards SJ et al. Cytometry 2007 72B 291-298
47
SeguimientoClon de hematíes con eculizumab
HPN clásica 60 diagnóstico
Células control
HPN clásica 95 1 año con eculizumab
48
SeguimientoClon de neutrófilos con eculizumab
HPN clásica 94, diagnóstico
Células control
HPN clásica 98, 1 año con eculizumab
49
HPN CMF Temas pendientes

• El Registro Internacional de HPN requiere que los
  datos aportados sean lo más homogéneos posible
• El uso de diferentes técnicas complica la
  estandarización de los resultados
• No se dispone de criterios inmunofenotípicos
  validados para el diagnóstico de HPN
• Falta de consenso en la estrategia de análisis y
  en la selección de los anticuerpos
• Necesidad de reuniones de consenso

50
Citometría de Flujo Reunión de Consenso

• Objetivo principal intentar llegar a un consenso
  en los puntos esenciales del diagnóstico de HPN
  por CMF, para tratar de disminuir, en lo posible,
  las diferencias técnicas e intentar homogeneizar
  los resultados entre distintos laboratorios

Madrid, 27 de enero 2009
51
Citometria de Flujo Reunión de Consenso

• Deben analizarse al menos dos líneas celulares
  con al menos dos antígenos asociados a GPI
• Marcaje multiparamétrico
• Se recomienda el estudio de neutrófilos y
  hematíes
• Cálculo del tamaño del clon
• Granulocitos CD16, CD66, CD24 o CD55
• Hematíes CD59 o CD55/CD59 en marcaje
  combinado
• Monocitos CD14 y CD55
• En el estudio de HPN subclínica, se recomiendan
  técnicas de CMF de alta resolución y llegar a una
  sensibilidad de 0,1
• Realizar el estudio de hematíes y leucocitos de
  forma independiente
• Necesidad de disponer de un control de calidad
  externo

Madrid, 27 de enero 2009
52
La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y
Seguimiento de la Hemoglobinuria Paroxística
Nocturna (HPN)
III Reunión Anual de la Asociación Valenciana de
Hematología y Hemoterapia Castellón, 27 de
febrero de 2009

• Amparo Sempere
• Servicio de Hematología
• H.U. La Fe