Herramientas de laboratorio en el diagnstico y seguimiento de la infeccin por HBV

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Herramientas de laboratorio en el diagnóstico y
seguimiento de la infección por HBV

• Fabián Fay
• CIBIC Rosario Argentina

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Marcadores Serológicos

• HBsAg Antígeno de Superficie
• Anti-HBc (total) Anticuerpo anti-core total
• Anti-HBc (IgM) Anticuerpo anti-core a clase IgM
• Anti-HBs Anticuerpo anti-HBs
• HbeAg Antígeno e
• Anti-HBeAg Anticuerpo anti-e

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Marcadores moleculares

• HBV-DNA cualitativo.
• HBV-DNA cuantitativo Carga Viral.
• Mutantes pre-Core.
• Mutantes de Resistencia a antivirales.
• Genotipos de HBV.
• Otras mutantes de HBV.
• TAN en banco de sangre.

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Cómo comenzar el diagnóstico de una infección
por HBV ?

• HBsAg y Anti-HBc (total)

Posibilidades HBsAg () HBsAg (-)
HBsAg (-) Anti-HBc (total) () Anti-HBc
(total) () Anti-HBc (total) (-)
No existió contacto con el HBV
Diferenciar Hepatitis Aguda de Hepatitis Crónica
Anti-HBc Aislado
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1
VACUNACION
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1 - Detección de Anti-HBc (total) aislado

• HBsAg (-), Anti-HBc (total) ()
• A)Realizar Anti-HBs si Anti-HBs() implica
  infección pasada resuelta, paciente inmunizado.
• B)Si Anti-HBs (-), existen 3 posibilidades
• a) infección muy lejana con pérdida del Anti-HBs
  
• b)paciente con replicación residual / oculta de
  HBV, con HBsAg (-)
• c) falso positivo metodológico
• En este caso hacer 1 dosis de vacuna y medir al
  mes Anti-HBs
• Si Anti-HBs () con alto título implica a)
• Si Anti-HBs () con bajo título implica c),
  seguir plan de vacunación.
• Si Anti-HBs (-), implica situación b), ver
  replicación residual por PCR.

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2 - Diferenciar Hepatitis B aguda de crónica

• HBsAg () , Anti-HBc (total) ()
• Utilizar Anti-HBc (IgM)
• Si Anti-HBc (IgM) () INFECCION AGUDA
• Si Anti-HBc (IgM) (-) INFECCION CRONICA

DEFINIR FASE DE REPLICACION VIRAL Y ESTADIO DE
LA INFECCION CRÓNICA
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Qué marcadores usar para caracterizar una
Hepatitis B crónica?

• Utilizar los siguientes marcadores
• HBeAg
• Anti HBeAg
• HBV-DNA cualitativo
• HBV-DNA cuantitativo.

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Hepatitis B Crónica

• La utilización de los marcadores debe permitir
  diferenciar y estratificar a los pacientes entre
  las siguientes vairantes
• Hepatitis B crónica con HBV HBeAg () (cepa
  salvaje)
• Hepatitis B crónica con HBV HBeAg (-) (mutante
  pre-core)
• Hepatitis B crónica portador inactivo HBsAg ()

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Detección de HBV-DNA cualitativo

• Región amplificada 258pb de la región
  pre-core-core del HBV
• Aplicaciones
• Definición de replicación activa del HBV en
  pacientes con patrón compatible con infección
  crónica
• Definición de infección HBV oculta (HBsAg
  negativa)
• Monitoreo de respuesta de tratamiento antiviral
• Métodos comerciales, no comerciales
• Límites de detección 5 a 50 copias/ml

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Detección de HBV-DNA cuantitativo Carga Viral

• Permite detectar y cuantificar la viremia
• Sólo se utilizan métodos comerciales
• Rangos Heterogéneos de cuantificación de los
  ensayos
• Obliga a diluir valores altos
• Sólo permite utilizar los de mayor sensibilidad
  en monitoreo de tratamiento.
• Falta de standardización de las unidades de
  cuantificación del HBV DNA

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Unidades de Cuantificación de HBV DNA
1 equivalente Bayer
1 copia Roche
1 copia Digene
1 Unidad International
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Carga Viral de HBVEnsayos HBV DNA disponibles

• Digene Corp.
• Roche Molecular Systems
• Bayer Corp.

HBV Digene Hybrid-Capture I HBV Digene
Hybrid-Capture II Ultra-Sensitive Digene
Hybrid-Capture II Amplicor HBV Monitor Cobas
Amplicor HBV Monitor Cobas Taqman Versant HBV
DNA 1.0 Versant HBV DNA 3.0
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104
103
105
106
107
108
1010
109
1011
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Aspectos importantes a tener en cuenta en métodos
cuantitativos

• Siempre usar el mismo método cuando se maneja a
  un mismo paciente.
• Nunca informar valores mayores a un límite, sino
  realizar diluciones hasta obtener el valor real.
• Si bien los ensayos se informan en copias,
  equivalentes o UI, la curva del ensayo es lineal
  en log/log ? informar también resultados en logs
• La variabilidad de los ensayos como la curva se
  expresa en logs. Variabilidad intra-ensayo 0,25
  log. Diferencia clínica de 1 log.

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Hepatitis B Crónica HBeAg ()
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Hepatitis Crónica HBV mutante pre-core HBeAg (-)
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Hepatitis B crónica Transición a portador
inactivo de HBsAg
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Hepatitis B Mutante preCore HBe-

• Región mutada preCore. Mutación G1896A (stop
  codón). Efecto no se sintetiza HBeAg. Mecanismo
  Selección (presión inmune)
• Perfil de marcadores HBsAg (), HBeAg (-), Ac.
  Anti-HBe (/-), HBV-DNA viral alto
• En pacientes que se primoinfectan con mutantes
  HBe defectivas, pueden darse casos de Hepatitis
  Fulminante
• Métodos de detección Secuenciación región
  pre-Core, Lipa, PCR primer específica.

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Detección de Mutante pre-core

• Región amplificada región pre-core- core HBV-DNA
• Método gold standard Secuenciación.
• Método de aplicación clínica PCR-RFLP, INNO-
  LiPA HBV Pre Core Assay
• Aplicaciones
• Definición de aparición de mutantes pre-core en
  pacientes con infección crónica HBV, HBeAg (-)
  con HBV-DNA ().
• Definición de infección por mutantes pre-core en
  pacientes con infección HBV aguda con
  características clínicas compatibles con una
  Hepatitis Fulminante.

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Detección por PCR-RFLP de la mutante PRECORE en
HBV

• Mutación detectada G por A en el nt1896
• Método utilizado Nested-PCR-RFLP

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VIRUS HEPATITIS B Efecto del interferon sobre los
marcadores virales
Pre-Rx Intra Rx Fin Rx
Seguimiento R NR RS Relapser
HBsAg
/- HBeAg
/- -
- /- Anti-HBe -
-/ -
- HBV-DNA PCR
/- Carga
Viral Alta Bajando ND
Alta ND Alta Anti-HBc

Anti-HBs -
- - - -/
-
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HBV DNA Polymerasa
Análogos de Nucleosidos

• Inhibicíon de la síntesis de HBV DNA cadena a
  partir del templado de RNA pregenomico

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Análogos de Nucleosidos

• Inhibición específica de la actividad de HBV DNA
  pol/reverse transcriptasa
• competición con dNTPs
• bloqueo específico del sitio catalítico
• terminación de la elongación de la cadena de DNA.
• Inhibicíon de la síntesis de HBV DNA cadena a
  partir del templado de RNA pregenomico

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Carácterísticas de los análogos de nucleósidos

• Son moléculas VIROSTÁTICAS.
• El Clearance de la replicación del HBV solo
  ocurre si la respuesta inmune del paciente es lo
  suficientemente fuerte como para eliminar las
  células infectadas en contexto de inhibición de
  la producción de nuevos viriones.

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Ciclo de Replicación del HBV
Acción de Terapia antiviral
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Utilidad clínica de la medición del HBV-DNA
TRATAMIENTO
Evaluación de Respuesta y resistencia
Elección de Tx
Decision de Tx
Pronostico
Diagnostico
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Monitoreo de Tratamiento antiviral
HBV DNA
Droga Antiviral
1 log
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Ciclo de Replicación del HBV
Acción de Terapia antiviral
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Efecto de análogos nucleosídicos sobre los
marcadores virales. Ejemplo HBeAg()
Pre-Rx Intra Rx Fin Rx
Seguimiento R NR RS Resistencia
HBsAg
/- HBeAg
-
- Anti-HBe -
- -
- HBV-DNA PCR ND
ND ND Carga Viral
Alta ND ND Alta
ND Alta Anti-HBc

Anti-HBs -
- - - -/ -
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Monitoreo de Tratamiento antiviral
HBV DNA
Droga Antiviral
1 log
1 log
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Resistencia de HBV a antivirales

• La definición de patrones de resistencia
  requiere
• Nuevas estrategias antivirales
• Ensayos de genotipos característicos de
  resistencia
• Ensayos de cuantificación de carga viral con muy
  buena sensibilidad y rango activo de medición
  para el monitoreo optimo de la terpaia antivral
  del HBV

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Tecnologías utilizadas para el seguimento de
pacientes con antivirales y definición de
patrones de resistencia

• Secuenciación gold-standard
• INNO-LiPA HBV Drug Resistance Assay
• PCR-RFLP para búsqueda de mutaciones mas comunes
  en el sitio YMDD

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INNO-LiPA HBV DR Assay

• Puede detectar polimorfismos en
• codones 528, 552 y 555 de HBV pol
• codones 171, 172, 195, 196, 198 y 199 de HBsAg
• Altamente sensible y fácil de usar
• Permite detectar mutaciones YMDD 3-6 semanas
  antes de la secuenciación

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Detección de mutaciones en la Polimerasa del HBV
en tratamiento con Lamivudine. PCR-RFLP

• PCR-RFLP 3 reacciones de PCR independientes que
  amplifican fragmentos de 274pb, 181pb y 138pb del
  gen de la ADN polimerasa de HBV .
• Los distintos perfiles posibles que se pueden
  observar son los siguientes

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Mutaciones del HBV
Métodos para cada una de ellas, pueden
utilizarse diferentes métodos (LiPA, PCR primer
específica, PCR/hibridación específica, etc.)
pero el método de referencia es la secuenciación
de la región genómica específica. (Pawlotsky,
Gastroenterology 2002221554-1568)
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Genotipo HBV

• Se han descrito hasta ahora siete genotipos (A
  hasta G).
• Resta confirmar todavía su distribución mundial y
  que implicancias clínicas tendrían
• asociación con carga viral( demostrado en
  pacientes del sudeste asiático (Chu Lok
  Hepatology 200235)
• Tasa de seroconversión de HBeAg
• Patrones mutacionales región preCore-Core
• Severidad de la enfermedad hepática
• Manifestaciones clínicas
• Respuesta al tratamiento.
• Definición del genotipo secuenciación - LIPA