Title: I VETTORI VIRALI
1I VETTORI VIRALI
2Sistemi di trasferimento genico (trasduzione)
- Trasformazione (micro-organismi)
- Trasfezione (eucarioti)
- Infezione (se il vettore è un virus)
-
3Vantaggi dei vettori non virali
- Impossibile la generazione di nuovi virus
patogeni - Riduzione del rischio di reazione immunitaria
- Possono trasferire molti tipi diversi di
molecole, e permettono di trasdurre molecole di
DNA anche molto grandi - Possibilità di produzione in grandi quantità a
basso costo
Svantaggi dei vettori non virali
- Scarsa efficienza sia di trasduzione che di
integrazione (effetti non duraturi) - Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi
inserzionale
4Vettori virali
- Si ottengono inserendo il gene di interesse nel
genoma di diversi tipi di virus, sotto il
controllo di un promotore forte. - Il virus viene reso incapace di riprodursi
autonomamente, per evitare la diffusione di virus
ricombinanti (virus difettivo) - Il genoma viene ingegnerizzato con le tecniche
del DNA ricombinante, e trasfettato in
particolari linee cellulari capaci di produrre le
particelle virali ricombinanti (linee di
packaging). Queste complementano i difetti
introdotti nel genoma. - Il principale vantaggio consiste nellelevata
efficienza di trasduzione (fino al 100 delle
cellule).
5Vantaggi dei vettori virali
- Alta efficienza di trasduzione
Svantaggi dei vettori virali
- Possibilità di generare nuovi virus patogeni per
ricombinazione con eventuali virus presenti
nellospite - Mutagenesi inserzionale (per quelli che si
integrano in maniera casuale nel genoma) - Molecole di DNA di dimensioni limitate
- Reazioni immunitarie
- Costi elevati
6Vettori virali
- Virus difettivi possono essere prodotti solo in
particolari linee cellulari capaci di
complementare i difetti del virus. La loro
preparazione deve seguire queste fasi obbligate - Costruzione del genoma ricombinante
- Trasfezione del DNA nella linea cellulare capace
di produrre le particelle virali - Raccolta e analisi del virus
7Vettori virali caratteristiche principali
- Retrovirus possono infettare solo cellule in
divisione e si integrano stabilmente in maniera
casuale. - Lentivirus derivati del virus dell'HIV, possono
infettare cellule quiescenti e si integrano
stabilmente in maniera casuale. - Adenovirus esprimono ad alti livelli, non si
integrano stabilmente e danno grosse reazioni
immunitarie. - Virus adeno-associati (AAV) integrazione sito
specifica ed espressione stabile nel tempo,
difficile produrli ad alto titolo. - Herpes simplex infezione molto selettiva dei
neuroni, ma importanti effetti citotossici.
8RETROVIRUS
- Retrovirus murini (Moloney murine leukemia virus)
- Non sono noti membri capaci di provocare
- malattie nelluomo
- Sono inattivati dal complemento umano
- Possiedono un envelope lipidico e non resistono
- al disseccamento
- Lentivirus (HIV)
- Sono patogeni umani del torrente ematico
9RETROVIRUS
- virus con envelope
- genoma di 10 Kb costituito da una molecola di
RNAss - dopo linfezione il genoma è retrotrascritto a
DNAds - integra nel genoma dellospite (possibile
mutagenesi) - infetta solo celule in divisione
- gag codifica per le proteine del core
- pol codifica per la trascrittasi inversa
- env codifica per le proteine dellenvelope
- LTR long terminal repeat, comprendono
promotore/enhancers e sequenze necessarie per
lintegrazione - ? sequenze per il packaging
10vettori retrovirali REPLICAZIONE COMPETENTI
Sono virus integri nei geni che ne consentono la
replicazione, ma vengono privati di sequenze
indesiderabili (es src del RSV). Virus derivati
da RSV possono infettare in maniera efficiente
cellule di origine aviaria e in modo meno
efficiente cellule di mammifero. Virus derivati
dal virus della leucemia murina di Moloney
(MoMLV) sono invece più efficienti per le
infezioni di cellule di mammifero.
11vettori retrovirali REPLICAZIONE DEFICIENTI
La maggior parte delle applicazioni dei vettori
retrovirali richiedono che non vi sia
replicazione del virus dopo l'infezione
iniziale. A questo fine si possono sostituire
parte o tutte le sequenze codificanti del
retrovirus con quelle che si desidera trasferire
in questo modo il vettore stesso è incapace di
produrre le proteine necessarie alla propria
replicazione. Le funzioni richieste per
l'infezione iniziale del vettore sono
generalmente fornite da una linea cellulare detta
"packaging", che consente la produzione di virus
infettante ma incapace di replicarsi. Cruciale
nel giudicare lefficacia del sistema
vettore/linea di packaging è la valutazione della
frequenza con la quale si verifica la comparsa di
revertanti replicazione competenti (RCR) nella
popolazione di virus prodotto.
12vettori retrovirali REPLICAZIONE DEFICIENTI
I geni virali gag, pol ed env sono sostituiti con
il cDNA del gene di interesse. Il vettore che si
ottiene non è in grado di produrre le proteine
virali necessarie per un altro ciclo di infezione
(vettore difettivo nella replicazione).
Viene mantenuta la regione essenziale che
comprende i due LTR e la sequenza di packaging
(elementi-cis). Promotore virale o
eucariotico Marker di selezione (es. neomicina o
?-galattosidasi). Dimensione max del transgene
7.5 Kb.
13Le proteine virali necessarie per linfezione
iniziale vengono fornite in trans da
1)CELLULE DI PACKAGING
14Cellule di packaging La prima linea fu ottenuta
trasfettando permanentemente cellule NIH 3T3 con
un retrovirus MLV privato di ?. La linea
cellulare ottenuta complementa costrutti privi di
gag, pol e env, ma i titoli ottenuti sono bassi e
la frequenza di ricombinazione con produzione di
revertanti replicazione competenti (RCR) è troppo
elevata. Per ridurre ulteriormente le
possibilità di ricombinazione le proteine gag e
pol sono state espresse su un plasmide diverso da
quello esprimente env (split genome), e non più
sotto il controllo di LTR.
15Le proteine virali necessarie per linfezione
iniziale vengono fornite in trans da 2) VIRUS
HELPER
16PSEUDOTYPING
Ogni retrovirus è in grado di infettare un
particolare tipo cellulare grazie allespressione
di specifiche proteine codificate dai geni
env. Si sfrutta la capacità di un retrovirus di
incorporare le proteine env di un altro
retrovirus modificando i geni env è possibile
modificare il tropismo virale e/o aumentare il
titolo del vettore. Le proteine env endogene o
eterologhe vengono fornite in trans ad un
retrovirus difettivo per la replicazione.
17RETROVIRUS MURINI
- Vantaggi
- Non provocano malattie umane
- Inducono scarsa risposta immunitaria nellospite
- I transgeni possono essere espressi per tutta la
vita dellospite - Capacità di infettare efficientemente una vasta
gamma di tipi cellulari - Integrazione del materiale genetico recato dal
vettore nel genoma delle cellule bersaglio - alta efficienza di trasduzione
- Svantaggi
- Potenziale oncogeno perché si integrano nel
genoma dellospite in molteplici siti - Possono subire inattivazione trascrizionale in
vivo - Infettano solo cellule in attiva divisione
- Sono difficili da coltivare
- basso titolo (106-107)
18LENTIVIRUS
- Vantaggi
- Possono essere somministrati in vivo
- Non sono inattivati dal complemento
- Infettano sia cellule in divisione che
quiescenti - I transgeni possono essere espressi per tutta la
vita dellospite - Integrazione del materiale genetico recato dal
vettore nel genoma delle cellule bersaglio - Svantaggi
- Potenziale oncogeno perché si integrano nel
genoma dellospite in molteplici siti - Possono provocare malattia nelluomo
- Sono difficili da coltivare
19ADENOVIRUS
- virus senza envelope, struttura icosaedrica
regolare - genoma di 36 Kb costituito da una molecola di
DNAds - il genoma è fiancheggiato da sequenze ITR
(inverted terminal repeats) che servono come
origine di replicazione - dopo linfezione il virus entra nel nucleo della
cellula ospite e viene replicato - non si integra nel genoma dellospite (resta
episomale) - infetta sia celule in divisione che non
- dotato di ampio trofismo
20- E1A coinvolto nellattivazione della
trascrizione e nella promozione dellentrata
della cellula ospite in fase S (lega Rb inducendo
il rilascio del fattore di trascrizione E2F) - E1B blocca azione di p53, evitando entrata
della cellula in apoptosi - E2 codifica per 3 proteine coinvolte nella
replicazione del DNA e nella modulazione della
trascrizione (DNA-pol proteina terminale e
DNA-binding protein - E3 modula la risposta immunitaria
- E4 regola la trascrizione, la transizione
dellespressione da early a late gene, la
replicazione virale e lassemblamento dei virioni -
- L1-5 coinvolti nella produzione e
nellassemblaggio delle proteine del capside
21VETTORI ADENOVIRALI HELPER-DIPENDENTI
Generati sostituendo i geni E1a e E1b con il
transgene di interesse, posto sotto il controllo
di un elemento enhancer e di un promotore. Il
vettore così ottenuto è replicazione-difettivo e
le funzioni replicative vengono fornite in trans
da un virus helper (privato della sequenza ? e di
E1) . Il vettore è cresciuto in E1-expressing
cell-lines (es. cellule 293A che presentano una
copia del gene E1 integrata stabilmente).
22VETTORI ADENOVIRALI GUTLESS
Vettori adenovirali helper-dipendenti di nuova
generazione sono vettori ad alta
capacità. Sfruttano il fatto che tutte le
proteine adenovirali possono essere complementate
in trans, quindi quasi tutta la sequenza
codificante può essere sostituita dal transgene
che può avere dimensioni comprese tra 100b e i 36
Kb. Le uniche sequenze essenziali in cis sono le
ITRs e la sequenza ??.
23PRODUZIONE DI VETTORI GUTLESS
- Vettore virale contiene solo sequenze ITRs e ?
la cassetta di espressione del trangene - Cellule di packaging (293) esprimono gene E1
- Virus Helper E1-deleto, privo di sequenza ?.
Fornisce elementi strutturali
24VETTORI ADENOVIRALI
- Vantaggi
- Sicuri (non integrano nel genoma)
- Facilmente manipolabili
- Stabili
- Si ottengono alti titoli
- Ampio trofismo
- Infettano anche cellule quiescenti
- Possono veicolare inserti di grosse dimensioni
(36Kb) - Svantaggi
- Espressione transiente
- Alta risposta immunitaria
25VIRUS ADENO-ASSOCIATI (AAVs)
- virus a DNAss, con polarità o
- capside icosaedrico
- no envelope
- genoma fiancheggiato da sequenze ITRs, che
contengono la sequenza di packaging - solo due tipi di geni cap (proteine del
capside) - rep (proteine
necessarie per la replicazione e lintegrazione)
- per replicare necessita della presenza di un
adenovirus o di un herpes simplex virus (virus
helper) - in assenza di AV o HSV, i virus AAV integrano
stabilmente nel genoma della cellula ospite con
unalta frequenza, in una regione precisa del
cromosoma 19 (19q 13,3q-ter) - una successiva superinfezione con AV o HSV
attiva la replicazione del virus integrato
26VETTORI VIRALI ADENOASSOCIATI
- Il vettore è costruito sostituendo il transgene
a cap e rep, in quanto le sequenze ITRs
contengono tutte le informazioni necessarie per
lintegrazione e per il packaging. - Le cellule di packaging linea cellulare 293
trasfettata con un plasmide contenente i geni cap
e rep e successivamente infettata con un
adenovirus helper difettivo per E1 e privo della
sequenza ?. - Recentemente è stato sviluppato un nuovo sistema
di produzione il virus helper è sostituito con
un plasmide mini-Ad (contiene parte del genoma di
adenovirus)
27- Vantaggi
- Non sono patogeni per luomo
- Sono stabili
- Vengono ottenuti con alti titoli
- Alta efficienza di trasferimento genico
- Ampio trofismo
- Infettano sia cellule in divisione che non
- Integrazione del transgene
- Svantaggi
- Dimensioni ridotte del transgene (4.7 Kb).
Recentemente la capacità di questi vettori è
stata aumentata sfruttando concatamerizzazione
del genoma dei AAV dopo il traferimento. Si usano
due vettori, ciascuno codificante metà della
proteina di interesse. - Vettore ricombinante non ha integrazione sito
specifica e talvolta resta episomale
28HERPES SIMPLEX VIRUS (HSV-1)
- virus a DNAds
- capside icosaedrico
- envelope lipidico
- genoma costituito da almeno 80 geni, la metà
dei quali non essenziali
Inizialmente effettua uninfezione produttiva
nelle cellule epiteliali (ciclo litico), risale
poi attraverso le terminazioni dei nervi
sensoriali fino ai gangli dorsali. Qui stabilisce
uninfezione latente (non necessita di
espressione genica). Il ciclo litico viene
riattivato periodicamente le nuove particelle
virali vengono trasportate con trasporto
anterogrado e provocano lesioni a livello
epiteliale
29VETTORI HSV-1
- Grazie alla loro naturale capacità di stabilire
infezioni latenti nei neuroni, vengono utilizzati
per il trasporto di geni nel CNS. Lespressione a
lungo termine del transgene viene ottenuta
utilizzando dei promotori neurone-specifici,
attivati durante il periodo di latenza. - Possono trasportare geni di grosse dimensioni
(152Kb) - Esistono due tipi di vettori HSV-1
- Disabled HSV vectors
- Amplicon HSV vectors
30- DISABLED HSV VECTORS
Virus ricombinanti ottenuti eliminando uno o più
geni precoci immediati. Vengono prodotti in
cellule di packaging che complementano i geni
mancanti. Vettori di ultima generazione
prodotti eliminando il gene che codifica per la
glicoproteina-H di HSV-1 e cresciuti in una linea
cellulare che complementa questa proteina. I
virus ottenuti sono infettivi, ma possono
effettuare un solo ciclo di infezione.
31- AMPLICON HSV VECTORS
- Si usa un amplicone, un plasmide contenente
- unorigine di replicazione batterica
(generalmente da Escherichia coli), - unorigine di replicazione di HSV-1 (OriS)
- la sequenza di packaging di HSV-1
- il transgene
Il tutto viene inserito in una linea cellulare
infettata da un virus helper contenente i geni
regolatori e strutturali mancanti.
32PRODUZIONE DI VETTORI VIRALI
- Tre fattori determinano lefficienza di
produzione di un vettore virale - Lla natura del vettore
- lla linea cellulare di packaging modificazioni
del ciclo cellulare al fine di favorire le fasi
di replicazione virale e inibizione dellapoptosi
(es. alcuni virus, quali SV40 e Epstein-Barr
hanno evoluto sistemi anti-apoptotici) - lle condizioni di coltura temperatura di
crescita, concentrazione del siero, tempo di
infezione, confluenza cellulare al tempo
dellinfezione Es. retrovirus emivita
aumentata di 4 volte e titolo virale aumentato di
5-10 volte portando la temperatura di crescita da
37 C a 32 C. -
33PURIFICAZIONE DI VETTORI VIRALI
- La resa di produzione di un vettore virale è
fortemente influenzata dallalto grado di purezza
richiesto. - Per facilitare il processo di purificazione si
crescono i vettori virali in terreni privi di
siero (bilancio tra diminuita produzione e
maggiore recupero) - Tecniche di purificazione
- centrifugazione in gradiente di CsCl (usato nei
laboratori) - cromatografia daffinità (produzione su larga
scala)
34Es. PRODUZIONE DI VETTORI ADENOVIRALI
- Vettore adenovirale
- vettore commerciale deleto in E1 e E3
- gene di interesse posto sotto il controllo di un
promotore forte (es. CMV) - sequenze necessarie per il packaging (ITRs,
sequenza ?, late gene)
- Cellule di packaging
linea cellulare 293A (cellule embrionali renali
umane), che contiene una copia dei geni E1
integrata stabilmente (complementazione in trans)
35- INSERZIONE DEL TRANSGENE NEL VETTORE
- Clonaggio del DNA di interesse mediante taglio
enzimatico del vettore, dellinserto (estremità
coesive) e successiva ligazione
36- TRASFEZIONE DELLA LINEA 293A CON IL VETTORE
1. The day before transfection, trypsinize and
count the 293A cells, plating them at 5 x 105
cells per well in a 6-well plate. Plate cells in
2 ml of normal growth medium containing
serum. 2. On the day of transfection, remove the
culture medium from the 293A cells and replace
with 1.5 ml of normal growth medium containing
serum. Do not include antibiotics. 3. Prepare
DNA-Lipofectamine complexes for each transfection
sample. 4. Add the DNA-Lipofectamine complexes
dropwise to each well. Mix gently by rocking the
plate back and forth. Incubate the cells
overnight at 37C in a CO2 incubator. 5. The
next day, remove the medium containing the
DNA-Lipofectamine complexes and replace with
complete culture medium (i.e. D-MEM containing
10 FBS, 2 mM L-glutamine, and 1
penicillin/streptomycin).
37- TRASFEZIONE DELLA LINEA 293A CON IL VETTORE
6. 48 hours post-transfection, trypsinize cells
and transfer the contents of each well to a
sterile 10 cm tissue culture plate containing 10
ml of complete culture medium. Caution Remember
that you are working with infectious virus at
this stage and in all subsequent procedures. 7.
Replace culture medium with fresh, complete
culture medium every 2-3 days until visible
regions of cytopathic effect (CPE) are observed
(typically 7-10 days post-transfection). 8.
Replenish culture medium and allow infections to
proceed until approximately 80 CPE is observed
(typically 10-13 days post-transfection). 9.
Harvest adenovirus-containing cells by squirting
cells off the plate with a 10 ml tissue culture
pipette. Transfer cells and media to a sterile,
15 ml, capped tube. Proceed to Preparing a Crude
Viral Lysate.
38Valutazione delleffetto citopatico
Day 4-6 post-transfection At this early stage,
cells producing adenovirus first appear as
patches of rounding, dying cells.
Day 6-8 post-transfection As the infection
proceeds, cells containing viral particles lyse
and infect neighboring cells. A plaque begins to
form.
Day 8-10 post-transfection At this late stage,
infected neighboring cells lyse, forming a plaque
that is clearly visible.
39- PREPARAZIONE DEL LISATO VIRALE
After you have harvested adenovirus-containing
cells and media, you will use several freeze/thaw
cycles followed by centrifugation to prepare a
crude viral lysate. The freeze/thaw cycles cause
the cells to lyse and allow release of
intracellular viral particles. 1. Place the tube
containing harvested cells and media from
Transfection Procedure, Step 9, page 11 at -80C
for 30 minutes. Remove tube and place in a 37C
water bath for 15 minutes to thaw. Repeat the
freezing and thawing steps twice. Note Do not
incubate samples at 37C for longer than 15
minutes. 2. Centrifuge the cell lysate in a
table-top centrifuge at 3000 rpm for 15 minutes
at room temperature to pellet the cell
debris. 3. Transfer the supernatant containing
viral particles to cryovials in 1 ml aliquots.
Store the viral stocks at -80C.
40- PREPARAZIONE DEL LISATO VIRALE
Once you have prepared a crude viral stock, you
may Amplify the viral stock by infecting
293A cells (see the next section for details).
This procedure is recommended to obtain the
highest viral titers and optimal results in your
transduction studies. Determine the titer
. Use this viral stock to transduce your
mammalian cells of interest to verify the
functionality of your adenoviral construct in
preliminary expression experiments.
41- AMPLIFICAZIONE DELLO STOCK DI VETTORI ADENOVIRALI
Once you have created a crude viral stock, you
can use this stock to infect 293A cells to
generate a higher titer viral stock (i.e. amplify
the virus). The titer of the initial viral stock
obtained from transfecting 293A cells generally
ranges from 1 x 10 7 to 1 x 108 plaque-forming
units (pfu)/ml. Amplification allows production
of a viral stock with a titer ranging from 1 x 10
8 to 1 x 109 pfu/ml and is generally
recommended. Remember that you will be working
with infectious virus. Follow the recommended
Federal guidelines for working with BL-2
organisms. Perform all manipulations within a
certified biosafety cabinet. Treat media
containing virus with bleach. Treat used
pipets, pipette tips, and other tissue culture
supplies with bleach or dispose of as
biohazardous waste. Wear gloves, a laboratory
coat, and safety glasses or goggles when handling
viral stocks and media containing virus.
42- AMPLIFICAZIONE DELLO STOCK DI VETTORI ADENOVIRALI
- The day before infection, trypsinize and count
the 293A cells, plating them at 3 x 10 6 cells
per 10 cm plate. Plate cells in 10 ml of normal
growth medium containing serum. - 2. On the day of infection, verify that the cells
are at 80-90 confluency before proceeding. Add
the desire amount of crude adenoviral stock to
the cells. - 3. Incubate the cells at 37C in a CO2 incubator
and allow infection to proceed until 80-90 of
the cells have rounded up and are floating or
lightly attached to the tissue culture dish
(typically 2-3 days post-infection). This
indicates that cells are loaded with adenoviral
particles. - 4. Harvest adenovirus-containing cells by
squirting cells off the plate with a 10 ml
tissue culture pipette. Transfer cells and media
to a sterile, 15 ml, capped tube. - 5. Place the tube containing harvested cells and
at -80C for 30 minutes. Remove tube and place
in a 37C water bath for 15 minutes to thaw.
Repeat the freezing and thawing steps twice. - 6. Centrifuge the cell lysate in a table-top
centrifuge at 3000 rpm for 15 minutes at room
temperature to pellet the cell debris. - 7. Transfer the supernatant containing viral
particles to cryovials in 1 ml aliquots. Store
the viral stocks at -80C. Proceed to Titering
Your Adenoviral Stock,.
43- TITOLAZIONE DELLO STOCK DI VETTORI ADENOVIRALI
- Before proceeding to transduce the mammalian cell
line of interest and express your recombinant
protein, we highly recommend determining the
titer of your adenoviral stock. While this
procedure is not required for some applications,
it is necessary if - You wish to control the number of adenoviral
particles introduced to each cell - You wish to generate reproducible expression
results - To determine the titer of an adenoviral stock,
you will - Plate 293A cells in 6-well tissue culture plates.
- Prepare 10-fold serial dilutions of your
adenoviral stock. - Infect 293A cells overnight with serial dilutions
of adenoviral stock. - Perform a plaque assay by overlaying the infected
293A cells with an agarose/plaquing media
solution. Allow 8-12 days for plaques to form. - 5. Stain and count the number of plaques in each
dilution
44- TITOLAZIONE DELLO STOCK DI VETTORI ADENOVIRALI
A plaque assay. Serial dilutions of virus have
been plated on confluent monolayer cultures of
cells. The cells are stained after a period of
time in which a single virus infects a cell,
produces new virus particles and infects
surrounding cells. The white areas show areas of
the culture in which the cells have been killed.
Each "plaque" is the result of the presence of
one original infectious virus particle.
10-4
10-5
10-6
10-4 dilution confluent undeterminable 10-5
dilution 59 10-6 dilution 4.5
Thus, the titer of this viral stock is 5,2 x 106
PFU/ml (i.e. average of 59 x 105 and 4.5 x 106).
45- DETERMINAZIONE DEI REPLICATION-COMPETENT
ADENOVIRUS (RCA)
It is possible for homologous recombination to
occur between the E1 genomic region in 293 cells
and the viral DNA, causing the gene of interest
to be replaced with the E1 region, and resulting
in generation of a wild-type,
replication-competent adenovirus (RCA) To
determine the number of RCA per ml,
60-mm-diameter dishes of A549 cells (not
packaging cells) were inoculated with 0.2-ml
dilutions of the viral stocks for a period of 2 h
with intermittent shaking. After adsorption, a
standard plaque assay was performed, and plaques
were enumerated at day 13).
RCA frequency
46VETTORI VIRALI PER TERAPIA GENICA es.FIBROSI
CISTICA
- La fibrosi cistica è causata da una mutazione nel
gene regolatore della conduttanza trasmembrana
(CFTR), che codifica per una proteina canale del
cloro localizzata a livello apicale della
membrana delle cellule epiteliali. - Vettori adenovirali umani E1-replicazione-deficien
ti che esprimono il gene CFTR. - Ottimi risultati ottenuti in animali (espressione
per almeno 6 settimane), scarsi risultati
nelluomo (espressione per 2-4 settimane).
Possibili spiegazioni - muco presente nel tratto respiratorio ostacola
linfezione virale - il recettore riconosciuto dalladenovirus si
trova sulla membrana basolaterale delle cellule
epiteliali - alta probabilità di riscontrare anticorpi diretti
contro il vettore. - Attualmente, la terapia con vettori virali
prevede una somministrazione del vettore 1 o 2
volte al mese.
47VIRUS ONCOLITICI TRATTAMENTO DEL CANCRO
- Si sfrutta lazione litica dei virus per
eliminare selettivamente le cellule tumorali. - STRATEGIE PER GENERARE VIRUS TUMORE-SELETTIVI
- 1)TUMORE-SELETTIVITA INTRINSECA
- Si utilizzano dei virus che intrinsecamente
lisano cellule tumorali - Es.
- Newcastle-disease virus (NDV)
- Virus della stomatite vescicolare (VSV)
- Virus a RNA sensibili allinterferone ? non si
riproducono nelle cellule normali.
48VIRUS ONCOLITICI TRATTAMENTO DEL CANCRO
- 2)ATTENUAZIONE DEI VIRUS WT
- Vengono deleti alcuni geni virali essenziali per
la replicazione, che sono poi complementati in
trans solo nelle cellule tumorali ? la
replicazione è ristretta alle cellule tumorali - Es.
- HSV privo di gene che codifica per timidino
chinasi e/o ribonucleotide riduttasi. Questi
enzimi non vengono espressi nelle cellule
quiescenti, ma vengono up-regolati in fase G1 e S
(generano i dNTPs necessari per la sintesi del
DNA) ? virus replica solo nelle cellule in
elevata proliferazione.
49VIRUS ONCOLITICI TRATTAMENTO DEL CANCRO
- 2)ATTENUAZIONE DEI VIRUS WT
- Es.
- AV privo del gene che codifica per E1B-55K
Onyx-015 (primo AV replicazione-selettivo entrato
in trials clinici) - Trials clinici in fase I e II per il trattamento
del carcinoma delle cellule squamose della testa
e del collo (SCCHN). - Onyx-015 iniettato intratumoralmente
- Effetti collaterali sintomi influenzali.
- 20 dei pazienti positivi alla replicazione
virale, 14 mostrano benefici - Onyx-015 iniettato intratumoralmente
chemioterapia - 27 dei pazienti mostrano completa eliminazione
della massa tumorale 36 dei pazienti mostra
riduzione del 50 del volume della massa
tumorale. - In nessuno dei pazienti che aveva mostrato
risposta è ricomparso il tumore dopo 6 mesi,
mentre in tutti i pazienti sottoposti alla sola
chemioterapia si è osservata ricomparsa della
massa tumorale
50VIRUS ONCOLITICI TRATTAMENTO DEL CANCRO
3)TRASCRIPTIONAL TARGETING I geni virali
essenziali per la replicazione vengono posti
sotto il controllo di promotori e/o enhancers
cellulo-specifici Es. -AV replicazione-competenti
in cui E1A e E1B sono posti sotto il controllo
di promotori prostata-specifici (es. promotore
per il PSA, antigene prostata-specifico, e/o per
la probasina) sono usati per il trattamento del
carcinoma prostatico. -HSV con early genes posti
sotto il controllo del promotore dellalbumina
usati per il trattamento del carcinoma del
fegato.
51VIRUS ONCOLITICI TRATTAMENTO DEL CANCRO
4)CELLULAR TARGETING Modificazione del trofismo
virale mediante ingegnerizzazione delle proteine
del coat. Es. -HSV-1 modificati eliminazione
delle glicoproteine B e C di superficie e
inserimento dell interleuchina 13 ? virus che
infettano selettivamente cellule che esprimono il
recettore ?2 dellinterleuchina 13 (IL-13), come
le cellule tumorali cerebrali.
52VIRUS ONCOLITICI TRATTAMENTO DEL CANCRO
53VIRUS-DIRECTED ENZYME PRODRUG THERAPY (VDEPT) o
TERAPIA DEL GENE SUICIDA TRATTAMENTO DEL CANCRO
Si basa sulla somministrazione di un agente
chemioterapico in forma di profarmaco (non
tossico), combinata con lespressione
cellula-tumorale specifica dellenzima capace di
convertirlo nella forma tossica. Lenzima viene
veicolato mediante un vettore virale. N.B. la
forma attiva dellagente chemioterapico deve
avere una tossicità elevata, per ottenere un
EFFETTO BYSTANDER, e unemivita breve, per
minimizzare la tossicità sistemica.
54VIRUS-DIRECTED ENZYME PRODRUG THERAPY (VDEPT) o
TERAPIA DEL GENE SUICIDA TRATTAMENTO DEL CANCRO
Es. 1) SITEMA TIMIDINO CHINASI-GANCICLOVIR vetto
re retrovirale che esprime lenzima timidino
chinasi di HSV soministrato in situ in tumori
cerebrali. 2) SISTEMA CITOSINA
DEAMINASI-5-FLUOROCITOSINA sperimentazione in
corso per il trattamento del tumore al seno.
553) SISTEMA NITROTIROSINA-CB1954
(5-(aziridin-1-yl)-2,4-dinitrobenzamide)
- CB1954 viene convertito da una forma alchilica
monofunzionale debolmente tossica ad una forma
alchilica bifunzionale molto tossica, per azione
dellenzima NITROREDUTTASI codificata dal gene
nfsB di Escherichia coli B. - Vettore adenovirale umano (sierotipo 5)
replicazione deficiente (deleto in E1 e E3) che
contiene il gene nfsB sotto il controllo di un
promotore specifico. - Vantaggi
- la forma attiva di CB1954 diffonde attraverso la
membrana sanza bisogno di gap junction ? maggiore
effetto bystander - indipendenza dal ciclo cellulare
- CB1954 può essere attivato solo allinterno della
cellula (necessita di un cofattore) - ? rischio ridotto di tossicità.