BIOLOGIA MOLECOLARE PER CORSO DI LAUREA IN MEDICINA, Io ANNO

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• BIOLOGIA MOLECOLARE PER CORSO DI LAUREA IN
  MEDICINA, Io ANNO
• TESTO CONSIGLIATO Strachan e Read (UTET)
  Genetica umana molecolare
• Docenti
• Prof.ssaValeria Poli valeria.poli_at_unito.it
• Prof. Ferdinando Di Cunto ferdinando.dicunto_at_unit
  o.it
• Dipartimento di Genetica, Biologia e Biochimica
• Sezione di Biologia
• Via Santena 5 bis (II piano)

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CALENDARIO LEZIONI (FINO A PASQUA) CANALE
A CANALE B Marzo Marzo Lu 24 Mar
25 Lu 31 Aprile Aprile Mar 1 Mer
2 Gio 3 (ore 830) Mar 8 Lu 7 Gio 10 Mer
9 Lu 14 Mar 15 Mer 16 Mer 16 (ore
14-16)
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LUCIDIESAMI
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• - Introduzione la biologia molecolare e le sue
  implicazioni in Medicina
• - La tecnologia del DNA ricombinante
• ? Concetto di clonaggio e di genoteca
• ? Enzimi di restrizione
• ? Vettori plasmidici, virali e altro
• ? Sistemi per evidenziare gli acidi nucleici da
  campione biologico Southern blot, Northern blot,
  PCR
• ? La PCR in diagnostica e per identificazione
  individuale e di relazioni di parentela
• (NB Strachan, capitoli 4,5,6, 17.4)
• - Lorganizzazione del genoma umano e la sua
  evoluzione
• ? Lorganizzazione dei geni umani
• ? pseudgeni e frammento genici
• ? sequenze non codificanti
• ? sequenze ripetute ed elementi trasponibili
• (NB Strachan, capitolo 7 appunti)
• - Concetti e implicazioni del controllo
  dellespressione genica
• ? Schema riassuntivo del controllo trascrizionale
  di un gene eucariota.
• ? La cromatina nella regolazione della
  trascrizione (metilazione, acetilazione)

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• I progetti genoma e la loro importanza per la
  medicina
• ? Il progetto genoma umano
• ? Importanza dei progetti genoma degli organismi
  modello per la comprensione del genoma umano
• ? Era pre- e post-genomica
• (NB Strachan, capitolo 13 appunti)
• - Lidentificazione dei geni patologici
  nelluomo, patologia molecolare.
• ? Clonaggio posizionale
• ? Clonaggio funzionale
• ? Approccio del gene candidato
• ? Conferma del gene candidato
• ? Classi di mutazioni possibili
• (NB Strachan, capitolo 15 e 21 appunti)
• - Banche di dati genetici e genomici
• (NB Strachan, XIX-XXIII appunti)
• - Terapia genica
• ? Terapia cellulare e terapia genica

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SITI WEB UTILI

• http//www.bios.co.uk sito delleditore,
  illustrazioni e esercizi (?)
• http//www.whfreeman.com/biology/ lista di siti
  libri e link su internet
• http//www.whfreeman.com/lodish/index.htm
• estratto dal Lodish-Molecular Cell Biology
• Esercizi interattivi
• Esperimenti classici
• Animazioni
• Siti web correlati
• http//www.biointeractive.org/ laboratorio
  virtuale
• http//www.biology.arizona.edu/molecular_bio/molec
  ular_bio.html set di test interattivi e lezioni
  illustrative
• http//www.zoo.utoronto.ca/able/hotsites/hotsites.
  htm lista di siti caldi

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BIOLOGIA MOLECOLARE

• Scienza che studia le molecole della vita
  (macromolecole) con lo scopo di integrarle nei
  fenomeni biologici
• oppure
• Scienza che studia le macromolecole e come queste
  interagiscono per dare origine a fenomeni
  biologici
• Base fondamentale per la tecnologia del DNA
  ricombinante e lingegneria genetica

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• La comprensione dei meccanismi molecolari che
  regolano le interazioni tra macromolecole e il
  loro significato biologico passa attraverso la
  caratterizzazione della loro struttura primaria
  (sequenza).
• La conoscenza della sequenza del DNA genomico,
  sia codificante che non, ci permette la
  catterizzazione della struttura dei geni e della
  struttura primaria delle proteine o degli RNA da
  loro codificati.

TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE
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La tecnologia del DNA ricombinante

• Clonaggio del DNA (DNA ricombinante)
• Endonucleasi di restrizione
• Ibridazione di acidi nucleici
• Sequenziamento del DNA
• Reazione polimerasica a catena (PCR)

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DEFINIZIONI

• Complementarieta una sequenza nucleotidica S e
  la complementare di S se i due filamenti possono
  appaiarsi secondo la regola di Watson e Crick
• Ibridizzazione lappaiamento di 2 molecole di
  DNA o RNA complementari
• Tm (temperatura di fusione) temperatura alla
  quale il 50 di una certa sequenza nucleotidica
  e ibridizzata al suo filamento complementare.
• Sonda molecola di DNA o RNA a singolo filamento
  con una sequenza specifica, marcata e utilizzata
  per visualizzare la presenza della sua
  complementare tramite ibridizzazione.
• Oligonucleotidebreve filamento di acido
  nucleico, che puo essere sintetico
• DNA polimerasi gruppo di enzimi che possono
  copiare una sequenza di DNA sintetizzando il
  filamento omologo. Necessitano di un
  oligonucletide di innesco (primer) appaiato al
  filamento stampo
• DNA ligasi catalizza la formazione di legame
  fosfodiesterico tra 2 molecole di DNA con
  estremità compatibili
• Trascrittasi inversa enzima che e in grado di
  copiare una molecola di RNA in una di DNA
  complementare
• cDNA copia in DNA dellRNA messaggero

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Il clonaggio del DNA

• Clonaggio viene generata una molecola di DNA
  ricombinante, cioe isolata dal suo contesto e
  introdotta in un replicone (una unita di DNA
  capace di replicarsi detto vettore).
• Questa molecola di DNA ricombinante viene
  introdotta in un sistema cellulare appropriato
  (in genere batteri derivati dall Escherichia
  coli).
• Tutti i discendenti di questa singola cellula,
  detta clone, conterranno la medesima molecola di
  DNA ricombinante originariamente isolata,
  permettendo di produrne quantita praticamente
  illimitate

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(No Transcript)
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ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE
-Nel 1970 Hamilton Smith ha isolato il primo
enzima che taglia il DNA a livello di una
sequenza nucleotidica specifica. -Endonucleasi di
restrizione e metiltransferasi formano il SISTEMA
DI MODIFICAZIONE E RESTRIZIONE dei batteri.
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-Le metiltransferasi metilano le basi del DNA
appena sintetizzato -Sistemi di Restrizione e
modificazione sono stati scoperti in
molti batteri -In genere vengono metilati C5 di
anello citosina
N4 di anello citosina
N6 di anello
adenina COSA SERVE AL BATTERIO IL SISTEMA DI
RESTRIZIONE- MODIFICAZIONE? A evitare infezioni
da parte di fagi (se il loro DNA non è
metilato nei punti giusti verrà tagliato) -Molti
fagi hanno sviluppato un sistema di
anti-restrizione
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TIPO II Costituite da due subunità
1-metila il DNA 2-taglia FUNZIONANO ANCHE
SEPARATE! RICONOSCONO SEQ PALINDROMICHE TAGLIA
NO ALLINTERNO DI SEQ RICONOSCIUTE O A
DISTANZA DEFINITA. UTILIZZATE PER MAPPARE E
CLONARE IL DNA.
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ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO
II -Servono a tagliare il DNA in modo preciso e
prevedibile -Sono stati isolati più di 1200
enzimi da procarioti -Riconoscono più di 130
diverse sequenze nucleotidiche (sequenze
palindromiche di 4,6 o 8 nucleotidi). EcoRI
E genere Escherichia co specie coli
G/AATTC R ceppo RY13 CTTAA/G I
prima endonucleasi isolata BamHI B
genere Bacillus am specie
amyloliquefaciens G/GATCC H ceppo
H CCTAG/G I prima endonucleasi
isolata
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TIPO DI TAGLIO -BLUNT ENDS O TAGLIO NETTO Es.
SmaI 5-CCC GGG-3 5-CCC-3 5-
GGG-3 3-GGG CCC-5 3-GGG-5
3-CCC-5 -STICKY ENDS O CODINE ADESIVE -5
PROTRUDING -3 PROTRUDING Es. Eco RI (5
PROTRUDING) 5-G/AATTC-3 5-G-3
5-AATTC-3 3-CTTAA/G-5 3-CTTAA-5
3-G-5 Es. Kpn I (3 PROTRUDING) 5-GGTAC/C-3
5-GGTAC -3 5-C-3 3-C/CATGG-5
3-C-5 3-CATGG-5
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QUANTE VOLTE TAGLIA UN ENZIMA DI RESTRIZIONE? La
maggior parte riconosce palindromi di 4 o 6
nucleotidi se assumiamo che i 4 nucleotidi siano
distribuiti a caso nelle molecole di DNA -per
enzimi che riconoscono palindromi di 4 nt si avrà
IN MEDIA un taglio ogni 256 nucleotidi
(4x4x4x4). -per enzimi che riconoscono
palindromi di 6 nucleotidi avremo IN MEDIA un
taglio ogni 4.096 nucleotidi (46).
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(No Transcript)
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Frammenti con estremita coesive complementari
possono essere facilmente legati covalentemente
EcoRI
TaqI
Le estremita coesive compatibili si appaiano, e
igruppi 3-idrossilico e 5-fosfato di 2
frammentiappaiati si trovano cosi ad essere
adiacenti
HindIII
La DNA ligasi (derivata dal batteriofago
T4)catalizza la formazione di un legame
fosfodiesteretra i gruppi 3-idrossilico e
5-fosfato
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Clonaggio vettori plasmidici
I plasmidi sono molecole di DNA extra-cromosomali
che si auto-replicano Sono presenti in natura
in batteri, lieviti e alcuni eucarioti superiori,
in uno stato di relazione parassitica o
simbiontica verso la cellula ospite Molti
plasmidi contengono caratteri (geni) che arrecano
beneficio alla cellula ospite (es. resistenza a
un antibiotico) Molti plasmidi sono in grado di
auto-trasferirsi da una cellula allaltra.
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(No Transcript)
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Clonaggio in vettore plasmidico
generato tramite restrizione
DNA ligasi
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Limiti del clonaggio in vettori plasmidici

• Bassa efficienza di trasformazione e bassa
  densitaa cui si possono crescere le colonie
• limitata capacita di contenuto
• uso di vettori derivati dal batteriofago l,
  particolarmente per lanalisi di librerie
  genomiche o di cDNA

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Il batteriofago l
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(No Transcript)
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Vettori che possono contenere inserti più lunghi
di 40 kb

• BAC (bacterial artificial chromosome) gt300 kb
• PAC (basato sul fago P1) 85-100 kb
• YAC (yeast artificial chromosome) fino a 2 Mb

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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Le genoteche o librerie di DNA

• Libreria genomica collezione di cloni che
  include tutto il DNA genomico di una certa specie
  (es. il genoma umano aploide contiene circa 3x109
  coppie di basi, che possono essere contenute in
  circa 1.5x105 cloni di 20 kb ciascuno)
• Libreria di cDNA collezione di cloni che include
  tutte le specie di mRNA (trascritte in cDNA)
  espresse in un dato tessuto, incluso quelle piu
  rare

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Costruzione di una libreria genomica
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Costruzione di librerie genomiche utilizzando il
fago l come vettore
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Costruzione di una libreria di cDNA
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Analisi dei cloni ottenuti

• Crescita dei cloni, purificazione del DNA
  plasmidico e analisi con enzimi di restrizione
• Sequenziamento

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Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di
diversa lunghezza tramite elettroforesi
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Visualizzazione dei frammenti separati per
elettroforesi
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MAPPE DI RESTRIZIONE
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Mappare multipli siti di restrizione
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(No Transcript)
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(No Transcript)