Laboratorio No' 12

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Biología 3051 L Laboratorio 12 Biología
molecular Andrea Arias Garcia

• Laboratorio No. 12
• Biología molecular
• Instructora Andrea Arias Garcia

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El Núcleo

• El núcleo es un organelo característico de las
  células eucariotas.
• El material genético de la célula se encuentra
  dentro del núcleo en forma de cromatina

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Cromatina y cromosoma

• Un cromosoma es una molécula muy larga de ADN
  que contiene una serie de genes.
• Un cromosoma está formado por dos cromátidas. En
  cada una de ellas hay un filamento de ADN
  replegado idéntico en ambas cromátidas.

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El ADN

• La molécula de ADN está constituída por dos
  largas cadenas de nucleótidos unidas entre sí
  formando una doble hélice.

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Los nucleótidos

• Un nucleótido es una molécula compuesta por
• Una pentosa
• ribosa
• desoxirribosa
• Ácido fosfórico
• Una base nitrogenada, que puede ser
• adenina
• guanina
• citosina
• timina
• uracilo

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Partes de un nucleótido
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Estructura del ADN

• La estructura del ADN está definida por la
  "secuencia" de las bases nitrogenadas.
• Este orden constituye las instrucciones del
  programa genético de los organismos.

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Las bases nitrogenadas

• La unión de las bases se realiza mediante puentes
  de hidrógeno
• Este apareamiento está condicionado químicamente
  de forma que la adenina (A) sólo se puede unir
  con la Timina (T) y la Guanina (G) con la
  Citosina (C).

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MÓdelo del ADN
Watson y Crick (1953)
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Biología molecular

• La biología molecular es una herramienta para
  estudiar las relaciones evolutivas entre los
  organismos.
• Estudia el ADN y los genes que contiene.
• Todas las células contienen ADN que caracteriza a
  los organismos vivos. Por cambios y mutaciones en
  el ADN tenemos organismos compuestos por pocos
  cientos de bases hasta organismos mas complejos.

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Enzimas de restricción y electroforesis de ADN
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Enzimas de restricción

• También conocidas como endonucleasas. Son
  extraídas de organismos procariotas (bacterias)
  donde actúan como un mecanismo de defensa para
  degradar ADN exógeno.
• Su nombre esta dado según el genero y la especie
  de la bacteria de donde se aisló. Ej
• Eco RI E genero Escherichia
• co especie coli
• R cepa RV 13
• I primera endonucleasa
  aislada

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Enzimas de restricción

• Son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester
  del material genético a partir de una secuencia
  que reconocen.
• Permiten cortar ADN de hebra doble, donde
  reconocen secuencias palindrómicas (secuencias
  que se leen igual en ambas direcciones)

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Enzimas de restricción

• Al cortar el ADN las enzimas de restricción
  pueden producir dos tipos de cortes cohesivos y
  abruptos.
• Abruptos cortan las hebras ADN en la misma
  posición
• AATATT
•   TTATAA

• Cohesivos cortan la doble hebra de ADN de manera
  escalonada.

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Factores que afectan la actividad de las enzimas
de restricción

• Pureza del ADN la presencia de contaminantes
  como proteínas, cloroformo, etanol etc. inhiben
  la endonucleasa.
• Temperatura y pH pueden afectar la estabilidad y
  la actividad de las endonucleasas.
• Amortiguador (buffer) adecuado este provee el
  ambiente que necesita la enzima para trabajar en
  condiciones optimas.

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Electroforesis

• La electroforesis es un método que permite el
  desplazamiento de una molécula dentro de un campo
  eléctrico. La molécula con carga se mueve en
  dirección al electrodo con signo opuesto.
• En la electroforesis se aplica un campo eléctrico
  a lo largo de un soporte físico, generalmente
  geles de agar, agarosa, almidón, acrilamida,
  también se pueden usar otros soportes como las
  tiras de acetato de celulosa.
• Las moléculas que posean una carga neta
  (proteínas y ácidos nucleicos) se moverán dentro
  del campo eléctrico, separándose a medida que
  pasa el tiempo.

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Cámara de electroforesis
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La agarosa

• La agarosa es un polisacárido de galactosa
  (originalmente obtenido de algas, como el
  agar-agar, pero de composición más homogénea),
  cuyas disoluciones (típicamente de 0,5 a 2) 
  poseen la propiedad de permanecer líquidas por
  encima de aprox. 50ºC y formar un gel,
  semisólido, al enfriarse.
• Este gel está constituido por una matriz o trama
  tridimensional de fibras polimericas, embebida en
  gran cantidad de medio líquido, que retarda el
  paso de las moléculas de ácido nucleico a su
  través, en mayor medida cuanto más grandes sean
  éstas.

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Preparación del gel
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Factores que inciden en la electroforesis

• La carga eléctrica de las moléculas
• El pH del medio.
• El tamaño de las moléculas Las moléculas de DNA
  y RNA son en general demasiado grandes para que
  avancen a una velocidad razonable por los geles,
  por lo que lo habitual es fragmentarlas antes de
  someterlas a electroforesis.

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Para servir la muestra

• Al preparar el gel enfriando la agarosa en un
  molde adecuado, se dejan en él unos huecos o
  pocillos para poder introducir luego en ellos la
  muestra, y que así ésta se vea obligada a
  introducirse en el seno del gel cuando apliquemos
  el campo eléctrico

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Procedimiento

• Para preparar TBE 1X
• Si se usa TBE 20X, para preparar 100 ml echar en
  probeta 5 ml de TBE 20X y echar agua destilada
  hasta llegar a 100 ml.
• Si se usa TBE 10X 10 ml de TBE 10X y echar agua
  destilada hasta llegar a 100 ml.

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Procedimiento

• Elaboración de agarosa
• 2 microtubos (1 gramo) de agarosa más 100 ml de
  TBE 1X
• Mezclar en erlenmeyer LIMPIO y poner en hot plate
  USAR GUANTE DE CALOR y agitar girando la mezcla
  hasta que hierva y se vean las burbujas en la
  superficie.
• Saque de hot plate y deje enfriar(50C)
• Vertir en bandeja empezando en una esquina
• Coloque la peinilla
• Deje que solidifique.

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Activación del DNA

• El DNA se prepara añadiendo 100 microlitros de
  agua destilada y dejando a temp ambiente por 5
  minutos y agitar luego. Colocar en hielo o
  nevera luego mientras se usa.

100 uL de Agua destilada
Incubar por 5 min. a temperara ambiente
DNA
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Utilización de Enzimas de restricción

• 2 microlitros de DNA y 18 de agua destilada (con
  la punta de micropipeta, agitar) y colocar a 37
  C por 20-30 minutos. LA TEMPERATURA ES CRITICA,
  no dejen que suba!!! Luego ponga tubos en hielo
  mientras se preparan muestras.

2 uL de DNA 18 de agua destilada
Incubar por 30 min. a 37 C y luego colocar
en Hielo
Tubo pqñ Con enz.
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Para preparar muestras para corrida

• DNA sin cortar
• 2 microlitros de DNA
• 8 de agua destilada
• 2 de loading dye

• Para DNA cortado (restricciones)
• 10 microlitros de digestión
• 2 de loading dye

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Para correr gel

• Coloque un papel blanco debajo de la cámara
• Ponga bandeja en la cámara, de manera que las
  fosas queden en el lado negativo (negro),
• Asegúrese de que el buffer cubra el gel
• Quite CON CUIDADO la peinilla.
• Añada muestras a las fosas. NO MUEVA CAMARA!!!!
• Ponga tapa y prenda voltímetro. Se correra a 80
  voltios
• Deje que corra el gel hasta llegar aprox. a media
  pulgada del extremo positivo.

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Teñir

• Poner el gel en bandeja y cubrir con tinte.
• Dejar por media hora, agitar de vez en cuando.
• Sacar gel (usen guantes!!!) y poner en agua a
  lavar hasta que destiña bastante. Ver en
  iluminador.

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Fotografía electroforesis de ADN
ADN enzimas de restricción
Fragmentos de ADN
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