Sin t

1
Genoma funcional Es necesario hacer un estudio
funcional del genoma, la predicción de genes no
es siempre factible del análisis de sus
secuencias solamente. Estudios de mRNA, como
permiten los arrays , no son un reflejo directo
del contenido de una proteína en la célula
2
Multiples isoformas de una proteína se pueden
generar por procesamiento de RNA. A su vez el
mRNA tiene una determinada estabilidad y
eficiencia de traducción, y las proteínas pueden
estar reguladas por mecanismos post-traduccionales
.
PROTEOMICA
PROTEOMA Conjunto de PROTEínas expresadas a
partir de un genOMA (1990) PROTEOMICA Es el
campo que involucra la identificación,
caracterización y cuantificación de proteínas de
un tejido o tipo celular
3
EXPRESION Permite generar mapas cuantitativos de
de las proteínas expresadas en un tipo celular o
tejido. - Análisis de co-expresión de las
proteínas identificación de
caminos biológicos - Efecto de drogas o
estímulos biológicos - Identificación de
markers para enfermedades LOCALISOMA mapeo de
localización de proteínas - Asignar
funciones - Estudio de redes de proteínas
PROTEOMICA ESTRUCTURAL Mapas estructurales y
conformación 3D - Relaciones estructura
-función - Predicción de estructuras a
partir de secuencia - Identificación de
ortólogos estructuralmente relacionados
PROTEÓMICA
4
(No Transcript)
5
METODOLOGIAS BASICAS
DIRECTAS
INDIRECTAS

Tejidos
Libraries de expresión
Células Fracciones Complejos
específicas subcelulares Mltiproteicos
Identificación de interaccíones prot -prot y
proteína ligando - Fago diplay - Pull-down -
Doble híbrido
Resolución de proteínas Geles 2D, MALDI ,
Proteína arrays, Chips
Cuantificación , caracterización
Bioinformática
6
SEPARACION Y IDENTIFICACION DE PROTEINAS
GELES 2D y EPECTROMETRÍA DE MASA
Geles 2D (separación por carga y masa molecular),
identificar y cuantificar.
Muestras de dos situaciones diferentes son
analizadas por geles 2D, el análisis y
cuantificación se hacen por comparación con el
control
VENTAJAS
DESVENTAJAS - resuelven
proteínas que sufrieron modificaciones -
Proteínas muy hidrofóbicas no
post-traduccionales
entran al gel

- No resolución de
proteínas muy
ácidas o
muy básicas pI3 o 10
- No
detección de proteínas poco

abundantes

7
Revelado Plata, proteínas fosforiladas 32P, 33P
Analíticos
Geles 2D
Preparativos
o inmunobloting
Ejemplo de base de datos para 2D
sopts id
Higado 2413 138 Humano Riñon
2896 44 Hela
1271 46 nucleolo Otros organismos
Arabidopsis, Dyctiostelium, E. Coli, Levaduras,
raton. Base ExPaSy 2D
Identificación Secuenciación Edman
Espectrometría
Datos a base de datos Información de las
proteínas tipificadas y mapas 2D
8
La utilidad de los geles 2D estaba poco
aprovechada hasta 1990s, por la dificultad en la
identificación de proteínas. A partir de fines de
1980s con MS tecnología, se acoplaron las dos
técnicas lo cual permitió una rápida
identificación de las proteínas
ESPECTROMETRIA DE MASA
Componentes básicos
Detector
Generador de iones
Analizador de masas
Generación de iones MALDI Matix Assisted Laser
Desorption ESI ElectrSpray Ionization
9
MALDI
Las proteínas se mezclan con una matriz ,
usualmente orgánica, y se permite que se evapore,
y se forman cristales. Sobre la muestra se
aplica un pulso de láser, que produce la
desorción y carga de la proteína . Matrices
10
ESI
En ESI la muestra de proteína con buffer es hecha
spray a través de una pequeña aguja al final de
la cual se aplica una diferencia de potencial.
El solvente se evapora y las partículas quedan
cargadas El spray se produce a partir de una
columna de HPLC de fase reversa.
11
ANALIZADORES DE MASA
A) TOF Típicamente la separación de masas
acoplado con MALDI es TOF, separador en base al
tiempo de vuelo de la molécula cargada, desde el
punto donde se generó y el detector
12
B) Quadruple analizador de masa En este caso
los iones son transmitidos a través de un campo
eléctrico creado por 4 cilindros de metal
Puede permitir el paso de todos los iones o solo
el paso de ciertos iones con determinada m/z
C) ION TRAP En este caso los iones viajan por un
campo eléctrico 3D, en este caso los iones van
llegando al detector de a una especie
13
(No Transcript)
14
El análisis de proteínas o péptidos por MS puede
ser dividido en dos categorías generales -
Análisis de péptidos o fingerprint mass peptide
las masas de los péptidos individuales en una
mezcla son medidos y usados para crear un
espectro de masa - Análisis de aminoácidos
conocido como tandem mass spectrometry o MS/MS,
es usado para fragmentar un péptido en péptidos
mas pequeños para deducir la secuencia de
aminoácidos.
15
(No Transcript)
16
Ejemplo Triple quadruple Para obtener secuencia
de aminoácidos
En una primera etapa los iones son separados por
m/z y transmitidos a un segundo cuádruple, a
partir de este se transmite un ion en particular
y pasa a la cámara de colisión . En la cámara de
colisión el ion es fragmentado por irradiación
con un gas inerte Los fragmentos del ion
pétidico son luego resueltos en base a su
relación m/z en el tercer cuádruple .
17
FRAGMENTACION
Los iones mas comunes que se producen al
fragmentarse el péptido son los b o los y según
la carga haya quedado retenida en el N-terminal o
en el C-terminal
18
Está graficado intensidad relativa en función de
la relación m/z
El espectro es interpretado por programas de
computadora, los picos del espectro difieren en
la masa exacta del aminoácido que les falta. Así
se puede ir determinando la secuencia de
aminoácidos de un determinado peptido.
19
(No Transcript)
20
Reacción con grupos sulfhidrilo de Cys
21
(No Transcript)
22
APLICACIONES DE MALDI
- Identificación de secuencias fosforiladas -Ident
ificación e proteínas provenientes de complejos
proteícos obtenidos por inmunoprecipitación o
pull down
23
(No Transcript)
24
Permite el fraccionamiento de una muestra
utilizando los principios de cromatografía, la
detección de las proteínas se realiza mediante
SELDI (semejante a MALDI) Ls Chips para
proteínas o Protein chips arrays están preparados
con diferentes propiedades cromatográficas -
intercambio anionico o cationico
- afinidad por metal
- fase reversa, etc
25
(No Transcript)
26
(No Transcript)
27
ARRAYS DE PROTEINAS
Glass-slides con proteínas unidas covalentemente
(grupos aldehidos reactivos) spots de 150-200 mm,
1600 spots por cm2 - interacciones
proteína-proteína - detección de sustratos de
quinasas de proteínas -identificación de targets
de pequeñas moléculas
28
Detección de sustratos de proteínas quinasa
29
(No Transcript)