Inactivacin epigentica del gen del envejecimiento prematuro del sndrome de Werner en cncer humano

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• Inactivación epigenética del gen del
  envejecimiento prematuro del síndrome de Werner
  en cáncer humano

Integrantes Burnovicz, Ana Della Mónica,
Ivana Díaz Carrasco, Juan
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Introducción

• El síndrome de Werner (WS) es una enfermedad
  autosómica recesiva.
• Se caracteriza por
• envejecimiento prematuro (presencia de canas,
  cataratas, osteoporosis, diabetes,
  ateroesclerosis y muerte entre tercera y quinta
  década de vida)
• inestabilidad cromosómica
• alta frecuencia de aparición de neoplasmas
  malignos.

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Introducción

• En pacientes con WS se encuentran mutaciones en
  el gen WRN.
• Cultivos de células con WS presentan
  inestabilidad genómica (con gran cantidad de
  deleciones, inversiones, traslocaciones, etc).
• La proteína WRN tiene actividad helicasa y
  exonucleasa y pertenece a la familia de
  helicasas RecQ (esenciales protectores del
  genoma).

4
(No Transcript)
5

• Estructura del dominio de actividad de la
  exonucleasa en la proteína WRN. Sitios de
  interacción en amarillo.
• Seis exo-subunidades de WRN forman un anillo del
  diámetro justo para rodear la hebra de DNA. Los
  sitios activos de los dominios miran al centro
  del anillo.

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Introducción

• En pacientes con tumores se presenta un alto
  porcentaje de pérdida de heterocigosidad en el
  loci de WRN (8p11.2-p12).
• Personas con el gen WRN mutado desarrollan un
  amplio espectro de tumores epiteliales y
  mesenquimales (causa principal de muerte antes de
  los 50 años).

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Objetivos

• Estudiar el estado de hipermetilación en islas
  CpG en las regiones promotoras del gen WRN en
  líneas celulares tumorales y en pacientes con
  cáncer.
• Estudiar el efecto de la reintrodución del gen
  WRN en células tumorales, con el gen endógeno
  metilado, para ver las propiedades supresoras de
  tumor del mismo.
• Ensayar los efectos de inhibidores de
  topoisomerasa en líneas celulares y pacientes con
  cáncer con y sin metilación del gen WRN.

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Análisis de hipermetilación en el promotor del
gen WRN en líneas celulares humanas cancerosas.

• A. Secuenciación bisulfítica (primers blancos)
• B. PCR metilación-específica (primers grises)

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Analizan siete líneas celulares humanas cancerosas

• Colon (C)
• HCT-116
• COLO-205
• Mama (M)
• MCF-7
• MDA-MB-231
• Linfocitos (L)
• HL-60
• U937
• REH

También usan líneas celulares humanas normales de
distintos tejidos Colon, Mama, Linfocitos, Piel
y Médula espinal y una línea mutante WS -/-
(homocigota mutante non-sense para WRN)
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Resultados

• A. Secuenciación bisulfítica

• -cada fila es un clon secuenciado
• cada columna es un sitio CpG
• (negro sitio CpG metilado)
• (blanco sitio CpG no metilado)

• -Ninguna línea normal muestra hipermetilación
• 4 de las 7 líneas cancerosas muestran
  hipermetilación en el promotor de WRN
• HCT-116 (C)
• COLO-205 (C)
• MDA-MB-231 (M)
• U937 (L)

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B. PCR metilación-específica en líneas celulares
cancerosas
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Análisis de expresión de WRN en líneas celulares
humanas cancerosas y respuesta a tratamiento con
agente desmetilante (ADC)

• C. RT-PCR para mRNA de WRN en líneas cancerosas
  metiladas (extracción de RNA total y RT-PCR de
  WRN)
• D. Western blot en líneas cancerosas metiladas y
  no metiladas (lisado proteico corrido en gel y
  revelado con anticuerpo marcado anti-WRN)
• E. Inmunofluorescencia en líneas cancerosas
  metiladas y no metiladas (revelado con anticuerpo
  fluorescente anti-WRN sobre cultivos celulares)

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Resultados
C. RT-PCR del mRNA de WRN en las cuatro líneas
cancerosas metiladas
-Todas tienen expresión nula o baja (MDA-MB-231)
del mRNA WRN. -Todas aumentan la expresión del
mRNA WRN al agregar el agente desmetilante.
ADC tratamiento con agente desmetilante GAPDH
control de carga de RNA (expresión
constitutiva)
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D. Western blot en líneas cancerosas metiladas y
no metiladas
-Las líneas metiladas tienen expresión nula o
baja (MDA-MB-231) de la proteína WRN, y esa
inactivación se revierte con ADC. -Las líneas no
metiladas si expresan la proteína WRN.
ADC tratamiento con agente desmetilante GAPDH
control de carga de RNA (expresión
constitutiva) WS -/- línea homocigota mutante
en WRN (control negativo)
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E. Inmunofluorescencia en líneas cancerosas
metiladas y no metiladas
Control sin tratar con ADC ADC tratamiento
con agente desmetilante DAPI tinción nuclear
Líneas metiladas
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Ensayo de actividad WRN-exonucleasa en líneas
cancerosas
Técnica se utiliza la proteina WRN
inmunoprecipitada de las distintas líneas para
ensayar la capacidad de degradar un sustrato
dsDNA con 5 overhang de 20 nucleótidos. El
producto es corrido en un Southern (SDS-PAGE).
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Resultados
Ensayo de actividad WRN-exonucleasa en líneas
cancerosas
-Las líneas metiladas y la homocigota mutante WS
-/- tienen un background de actividad exonucleasa
(posiblemente debido a la inmunoprecipitación de
una actividad exonucleasa inespecífica). -En las
líneas no metiladas aparece mas producto (mas
actividad exonucleasa) que en las metiladas. -Al
tratar la línea metilada U937 con el agente
desmetilante la cantidad de producto se
incrementa.
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Controles que faltan
- Expresión de mRNA y proteína WRN en células no
cancerosas (debería haber expresión ya que no
sufren hipermetilación en su promotor). -
Expresión de mRNA y proteína WRN en líneas
celulares no metiladas tratadas con agente
desmetilante ADC (para ver si ese agente químico
modifica la expresión per se)
Conclusión de la figura
En algunas líneas celulares cancerosas ocurre la
inactivación epigenética del gen WRN (por
hipermetilación de una isla CpG en su promotor),
llevando a pérdida de expresión a nivel mRNA y,
por ende, también a nivel proteína.
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Estudio de la capacidad de WRN de funcionar como
supresor del crecimiento de tumores.
Se realizó una transfección por electroporación
de cultivos tumorales mamarios con un vector de
expresión conteniendo el cDNA del gen WRN.

• Solo hay expresión de WRN en las células
  transfectadas con el gen (MDA-MB-231-WRN).

Técnica RT-PCR
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Análisis de la actividad de reducción de focos
celulares (in vitro) después de dos semanas de
selección con G418 y tinción con azul de metileno.

• La reexpresión del gen mostró actividad
  supresora de tumores (reducción de focos en un
  59/-10).

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Técnica Cuantificación densitométrica
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Efecto de la transfección con WRN sobre la
capacidad de crecimiento de las células tumorales
MDA-MB-231 (mama) in vivo (en ratones atímicos).
A los 30 días después de la infección de los
ratones con 106 células se disectaron los
tumores, se midieron y pesaron.

• Las células transfectadas con el vector vacío
  generaron tumores rápidamente a diferencia de las
  transfectadas con el gen WRN.
• Los tumores fueron seis veces mas largos en los
  ratones con el vector vacío que en los otros que
  tenían el vector con WRN.

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Análisis de inducción de apoptosis en líneas
celulares metiladas , no metiladas frente a
concentraciones crecientes de inhibidores de
topoisomerasas

• Las drogas inducen apoptosis masiva en las líneas
  metiladas pero no en aquellas que no están
  metiladas.
• La línea transfectada con WRN muestra resistencia
  a la apoptosis inducida por las drogas.

Graficó Indice de apoptosis vs concentración de
inhibidor.
Técnica Citometría de flujo
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Se repitió el experimento para otra línea celular
metilada con resultados similares.
Gráfico Indice de apoptosis VS concentración de
inhibidor.
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Análisis de rompimiento cromosomal en un línea
celular cancerosa metilada tratada con
inhibidores de topoisomerasas.
Técnica análisis citogenético de cromosomas en
metafase
Sin tratamiento con la droga
Tratadas con 50mg/ml de mitomicina

• Se observa rompimiento mínimo en las líneas con
  WRN metilada que no fueron tratadas con la droga
• Se observa rompimiento cromosomal masivo cuando
  estas líneas son tratadas con la droga y
  transfectadas con el vector solamente.
• Se observa resistencia a los efectos de la droga
  en esta misma línea al ser transfectadas con WRN.

Tratadas con 50mg/ml de mitomicina
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Cuantificación del rompimiento cromosomal
inducido por un inhibidor de topoisomerasa en
células cancerosa.
Técnica análisis citogenético de cromosomas en
metafase

• Las líneas no metiladas presentan una baja
  proporción de rompimiento cromosomal frente a la
  droga.
• Las líneas mutadas o metiladas presentan una alta
  proporción de rompimiento.
• La línea metilada que fue transfectada con el WRN
  muestra resistencia a la acción de la droga.

Gráfico Porcentaje de células tratadas con
mitomicina que presentan daño cromosomal.
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Ensayo de siRNA (small interference RNA) contra
el mRNA del WRN en células cancerosas no
metiladas

• Se observa que la expresión del gen es inhibida
  por el siRNA.

• Se observan alta proporción de rompimiento
  cromosomal en la línea celular que presenta al
  gen noqueado en presencia de inhibidores de
  topoisomerasas.

Técnica Western blot
Se puede establecer entonces una correlación ente
expresión del WRN y la sensibilidad de la línea
celular a los inhibidores de topoisomerasa.
Técnica análisis citogenético de cromosomas en
metafase
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Se estudio la prevalencia de la hipermetilación
en la isla CpG del promotor de WRN en pacientes
con cáncer por una PCR metilación-específica.
NLnormal lymphocytes IVD in vitro methylated
Porcentajes de tumores con metilación en WRN
37.9 colon, 37.5 hígado, 25 gástrico, 17.2
mama, 12.5 tiroides, 23.7 linfoma, 33.3
condrosarcoma, 11.1 osteosarcomas.
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Para verificar la correlación entre
hipermetilación y perdida de la proteína WRN en
tumores primarios

• Se hizo un estudio inmunohistoquímico de la
  proteína WRN en 16 tumores gástricos.

En todos los casos con el promotor sin metilar la
proteína estaba fuertemente expresada. En los
metilados no había expresión de proteína WRN.
Normal
Tumor no metilado
Tumor metilado
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• También se realizó un Western Blot sobre tumores
  colorectales revelando con un anticuerpo marcado
  contra la proteína WRN.

• En todos los casos donde el promotor no estaba
  metilado hubo expresión de proteína WRN.
• En la mayoría de los casos donde el promotor de
  WRN sí estaba metilado no hubo expresión (solo
  uno presentó mínima expresión).

MCF7 Línea celular cancerosa no metilada
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Estudio del tratamiento en pacientes con cáncer
de colon con la droga irinotecan (inhibidor de
topoisomerasas) con tumores con metilación del
WRN y sin metilación del mismo.

• Se observa un aumento en la sobrevida de
  pacientes con el WRN metilado
• Tiempo medio de vida de pacientes con WRN
  metilado39,4 meses sin WRN metilado 20,7 meses.

La presencia de metilación en el promotor de WRN
es un buen indicador para predecir un aumento en
la sobrevida en pacientes con cáncer de colon
tratados con irinotcan.
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Conclusiones y Discusión

• El gen WRN sufre inactivación epigenética en
  ciertas líneas celulares cancerosas y ciertos
  tumores primarios humanos.
• El gen WRN tiene características de supresor de
  tumores
• - su inactivación epigenética se correlaciona con
  una alta incidencia de cáncer.
• - su reintroducción en líneas con el gen WRN
  endógeno inactivado lleva a una disminución de la
  división celular tumoral.
• La presencia del gen WRN metilado se
  correlaciona con un aumento en la sensibilidad a
  tratamiento con irinotecan (agente
  quimioterapéutico inhibidor de topoisomerasas) en
  líneas celulares y en pacientes con cáncer
  colorectal.

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Líneas de investigación relacionadas
- Relación de la proteína WRN con otros
componentes del envejecimiento (proteínas del
D-loop telomérico) y con otros supresores de
tumores (como p53). - Estudios sobre la actividad
de la proteína WRN in vivo. Hay indicios de que
WRN actúa en mecanismos de reparación del DNA
(dominios helicasa y exonucleasa).
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GRACIAS!!!