3.3 Kiekybiniu po

1
3.3 Kiekybiniu požymiu lokusu (QTL)
identifikavimas
3.3.1 Ivadas. 3.3.2 QTL nustatymo populiacijos
sukurimas ir fenotipiniai požymiai. 3.3.3 QTL
paieškos molekuliniu žymenu sistemos. 3.3.4 QTL
nustatymo statistiniai metodai. 3.3.5 QTL
testavimas. 3.3.6 Miško medžiu QTL tyrimu
apibendrinimas. 3.3.7 Kandidatiniu genu
paieška. 3.3.8 QTL naudojimas selekcijoje.
2
3.3.1 Ivadas

• Kiekybiniu požymiu lokusai (ang. quantitative
  trait loci (QTL))- tai vietos chromosomose,
  kuriose yra genai, salygojantys kiekybinius
  požymius. QTL vietas žymi molekuliniai žymenys.
• Molekuliniai žymenys tai nedideles DNR molekules,
  kuriu nukleotidu sekos atitinka nukleotidu sekas,
  esancias geno sudetyje ar netoli ir paveldimos
  vienoje sukibimo grupeje.

• Individu atranka, panaudojant informacija apie
  genetinius žymenu sasajas su genais, vadinama
  atranka žymenu pagalba (angl. MAS marker
  asssisted selection)

3
Molekulinio žymens samprata

• Molekuliniai žymenys nustatomi specialiais DNR
  sukarpymo, specifiniu seku pagausimo, iRNR
  klonavimo metodais, kuriu rezultatas specifiniai
  DNR fragmentai elektroforezes gelyje

Laboratoriniu DNR tyrimu rezultatas
elektroforezes gelis
Lauko bandymas
C
B
DNR pavydžiai
A
Genu salygojanciu požymi buvimas nustatomas pagal
fenotipinio požymio buvima (pvz. ankstyva augimo
pradžia)
Su požymiais galimai susijes žymuo nustatomas
pagal specifinius DNR fragmentus elektroforezes
gelyje
4
QTL samprata

• Dauguma ekonomiškai svarbiu požymiu yra
  salygojami daugelio genu (poligenu).
• Šie genai vadinami kiekybiniais, nes kiekvieno
  geno itaka galima išreikšti skaitine verte
  (kiekybe).
• Kiekybiniu genu vietos chromosomose vadinamos
  lokusais (kiekybiniu požymiu lokusai- QTL).
• Tarp ju yra genai turintys didesne itaka požymiui
  (pagrindiniai genai).
• Galima surasti molekulinius žymenis susejusius su
  pagrindiniais genais ir naudoti kaip pagalbine
  priemone atrenkant individus (atranka žymenu
  pagalba (MAS)).

Kiekybini požymi salygojantys stipresnes itakos
genai, kuriu vietos chromosomose vadinamos
kiekybinio požymio lokusais (ang. trumpinys-
QTL).
5
QTL paieškos prielaidos
20

• Jeigu visi požymi itakuojantys genai turetu
  vienoda itaka, butu sunku juos visus atskirai
  identifikuoti ir naudoti selekcijoje.
• Kai kurie genai turi didesne itaka ar itakuoja
  kitu genu veikla (vadinami kiekybinio požymio
  lokusais).
• Tikslas rasti žymenis susijusias su šiais genais,
  galutinis tikslas- rasti pacius genus.
• QTL požymis salygojamas keliolikos genu žymens
  svarba priklausys nuo susijusio geno itakos
• Priklausomai nuo QTL, žymenys gali tureti
  skirtinga itaka požymio kintamumui

ŽymuoM
50
QTL1
Požymis kontroliuojami eiles genu, kuriu itaka
išreikšta procentais (pavyzdžiui kuo didesnis
procentas tuo daugiau medienos)
QTL2
15
ŽymuoN
5
5
5
6
Žymenu ir QTL sasajos nustatymo komponentai

1. Polimorfine populiacija ir požymis (daug
   skirtingu tikslinio geno formu) ir bent vienas iš
   tevu heterozigotinis.
2. Tinkama žymenu sistema tikslinio požymio QTL
   paieškai.
3. Kryžminimai (ar bus žymenys atskirti nuo genu per
   rekombinacija?).
4. Palikuonys QTL nustatymo populiacija (požymiu
   (QTL buvimo) ir žymenu sasajos ivertimas).
5. Žymens ir QTL sasajos ivertinimo statistiniai
   metodai

Daug alternatyviu geno formu
Statistiniai metodai požymio ir žymens sasajai
nustatyti
7
Žymenu ir QTL sasajos nustatymo principas (1)

• QTL nustatomi ivertinant sasajas tarp molekuliniu
  žymenu ir tiksliniu požymiu prieš ir po
  rekombinacijos (tevai? kryžminimai ? palikuonys).
• Tikrinama ar rekombinacija atskyre fenotipini
  požymi ir molekulini žymeni

Hipoteze netiesioginis žymuo M susijes su
teigiamu genu (G), žymuo m susijes su neigiamu
genu (g)
Principas kuo silpniau žymuo susiejas su genu,
tuo toliau yra ju lokusai chromosomoje, tuo
dažniau juos atskiria rekombinacija
Lytines lasteles žiedadulkese
Rekombinacija lytinu lasteliu formavimo metu iš
tevo ir motinos gautos porines chromosomos
pasikecia dalimis. Galimi 4 genotipai M-G M-g
m-G m-g
Porines chromosomos
Žymuo
3 rekombinantiniai genotipai (38 ) (QTL ir žymuo
nesusieja nes buvo atskirti)
5 nerekombinantiniai genotipai (QTL ir žymuo
vienoje sukibimo grupeje)
Genas
Pakankamo dydžio ir polimorfizmo tevine
populiacija
Kryžminimas
Ivertinimas, statistiniai metodai
8
Žymenu ir genu sasajos nustatymo principas (2)
Hipoteze netiesioginis žymuo M susijes su
teigiamu genu (G), žymuo m susijes su neigiamu
genu (g)
Anksti ir velai sezonini augima pradedantys p.
egles genotipai Baltijos regiono egles
populiaciju bandyme

• Atlikti kryžminimai teigiama požymi (gena G) ir
  jo žymeni M) turintis individas (velyva sezoninio
  augimo pradžia ir tiesus) kryžminamas su šio geno
  neturinciu individu (ankstyva augimo pradžia ir
  kreivas, daugiastiebis).
• Palikuonyse nustatyta, kurie iš ju turejo žymeni
  (M ar m) ir gena G ir g (pagal požymio išraiška
  fenotipe).
• Rekombinacijos dažnis tik 15. Žymens M
  patikimumas- 85

9
3.3.2 QTL nustatymo populiacijos sukurimas ir
fenotipiniai požymiai
Populiacijos sukurimo principas
1. Tevu parinkimas turintys norimus genus, kurie
identifikuojami pagal fenotipinio požymio
išraiška požymis turi buti paveldimas)
Molekuliniu žymenu sistema, galinti identifikuoti
DNR fragmentus susijusius su tikslinais genais
2. Kryžmindamas testas ar rekombinacija nutrauks
žymens ir geno sasaja?
3. Palikuonys QTL nustatymo populiacija
palikuoniu ivertinimas tikslu nustatyti kiek
palikuoniu turejo ir fenotipini požymi ir
molekulini žymeni sasajos stiprumas (nuo
100-200 medeliu)
Kiekviename etape medžiaga ir metodai parenkami
taip kad maksimaliai palengvintu tikslo
igyvendinima
10
Tevines poros
Teviniu poru parinkimo problema kaip parinkti
heterozigotines poras (bent viena iš tevu)? Nuo
to priklauso QTL nustatymui reikalingos
populiacijos sukurimo metodai Heterozigotinis
individas turi skirtingas požymi salygojancio
geno formas, vadinamas aleliais (polimorfinis
genas)
Po rekombinacijos
Rekombinacija tarp poriniu chromosomu lytineje
lasteleje
Homozigotos atveju sunku nustatyti ar
rekombinacija tarp žymens (M) ir geno (G), nes M
ir G vienodi abejose chromosomose (ivykus
rekombinacijai tarp M ir G vienoje chromosomoje,
žymuo M ar genas G patektu iš kitos chromosomos)
Nors žymuo M ir genas G buvo skirtingose sukibimo
grupese (nesusije), jie bus aptikti kartu
palikuonyse
Žymuo M ir genas G nesusije išreikštas genas G
netures žymens M
11
QTL populiacijos sukurimas (1)
Klasikinis modelis tikslas sukurti heterozigotas
2-oje kartoje (prielaida M1 susijes su Q1
(aukštas), o M2 su Q2 (žemas)
1 karta
Bus reikalingi kodominantiniai žymenys nes reikes
atskirti heterozigotinius palikuonis
Parenkami kontrastingu požymiu tevai
Žymuo
Galimas ir atgalinis kryžminimas su vienu iš tevu
(tik vienas iš tevu bus heterozingotinis, todel
bus galima nustatyti tik vieno iš aleliu sasaja
su QTL, todel dominantiniai žymenys butu
pakankami
Aukšcio QTL
Žema
Aukštas
2 karta
Tarpinis
Savidulka
Parenkami tarpinio aukšcio tevai, kurie yra
heterozigotiniai
Ar aukšti ?
Bandoma ar genotipai atitinka fenotipus pvz. ar
palikuonys tik su M1 žymeniu tikrai aukšciausi.
3 karta
Ar tarpiniai ?
Ar žemi ?
Jei neivyko rekombinacija tarp M ir Q, galimos 3
genotipu kombinacijos
Genotipas 3
Genotipas 1
Genotipas 2
3 karta QTL paieškos populiacija lyginamos
tokios sasajos M1-Q1, M2-Q2, pvz. ar yra
skirtumai tarp M1M1 ir M1M2 genotipu vidutinio
aukšcio? PROBLEMA su miško medžiais savidulka ar
giminiu kryžminimai mažai gyvybingi palikuonys
12
QTL populiacijos sukurimas (2)
Triju kartu modelis tikslas sukurti
heterozigotas 2-oje kartoje. Minusas reikia
3-ju kartu (nemažos laiko sanaudos) . Išeitis
panaudoti selekcines populiacijas su jau
atliktais kryžminimais.
1 karta
Motina žema
Tevas aukštas
Tevas aukštas
Motina žema
Žymuo
Parenkami kontrastingu požymiu tevai
Aukšcio QTL
Motina tarpine
2 karta
Tevas tarpinis
Parenkami tarpinio aukšcio tevai, kurie yra
heterozigotiniai
Ar Aukšti ?
Ar Tarpiniai ?
Ar Tarpiniai ?
Ar Žemi ?
3 karta
Bandoma ar genotipai atitinka fenotipus
Jei neivyko rekombinacija tarp M ir Q, galimos 4
genotipu kombinacijos
Genotipas 3
Genotipas 1
Genotipas 2
Genotipas 4
3 karta QTL populiacija lyginamos tokios
sasajos M1-Q1, M2-Q2, M3-Q3, M4-Q4, pvz. ar yra
skirtumai tarp M1M3 ir M1M4 genotipu vidutinio
aukšcio?
13
QTL populiacijos sukurimas (3)
Dvieju kartu modelis (1) tikslas parinkti
genetiškai tolimas tevines poras, tikintis, kad
bent viena ju bus heterozigotine (aukštos medžiu
genetines ivairoves panaudojimas galimi rušiu
hibridai).
Problema galimybe, kad tevai homozigotiniai
sprendimas kontroliniai keliu kandidatiniu
teviniu poru palikuoniu heterozigotiškumo tyrimai.
Kontroliniai heterozigotiškumo tyrimai
Motina tarpine
Tevas tarpinis
1 karta
Parenkami ženkliai skirtingos kilmes tarpinio
aukšcio tevai, tiketina- heterozigotiniai
aukštas-
-žemas
aukštas-
-žemas
2 karta
Tarpiniai Žemižemesni
Fenotipai aukšti tarpiniai aukštesni
Jei neivyko rekombinacija, galimos 4 genotipu
kombinacijos, taciau žymenys identifikuos tik M1
ir M3 genotipus bus lyginami tik 2-ju grupiu
fenotipai nukentes tikslumas
Lyginami
Genotipas 3
Genotipas 4
2 karta QTL populiacija tinka dominantiniams
žymenims lyginamos tokios sasajos pvz. M1 su Q1
(tevas) ir pvz. M3 su Q3 (motina).
14
QTL populiacijos sukurimas (4)
Dvieju kartu modelis (2 pusiau sibai) tikslas
parinkti potencialiai heterozigotini motinmedi ir
naudoti laisvo apsidulkinimo seklas. Vienodai
tinka dominantiniams ir kodominantiniams žymenims.
Problema galimybe, kad tevai homozigotiniai
sprendimas kontroliniai keliu kandidatiniu
teviniu poru palikuoniu heterozigotiškumo tyrimai.
Kontroliniai heterozigotiškumo tyrimai
Motina tarpine
Tevas žiedadulkiu mišinys
1 karta
Parenkami heterozigotiniai motinmedžiai (tevas
laisvo apdulkinimo)
Žemesni
Aukštesni
2 karta
Jei neivyko rekombinacija, galimos 2 genotipu
kombinacijos žymenys identifikuos tik M1 ir M3
genotipus bus lyginami tik 2-ju grupiu fenotipai

Genotipas 2
Genotipas 1
2 karta QTL populiacija lyginamos tokios
sasajos pvz. M3 su Q3 ir pvz. M4 su Q4.
15
Tiksliniai fenotipiniai požymiai (1)

• QTL nustatymo efektyvumas didžia dalimi priklauso
  nuo fenotipinio požymio.
• Kriterijai
• Genu salygotumo kompleksiškumas (vienos ir keliu
  grupes susijusiu genu) ir QTL nustatymo
  lengvumas.
• Ekonomine verte (QTL nustatymas duotu taikomaja
  nauda).
• QTL analizes tikslas nustatyti kiek genu
  kontroliuoja požymi ir koks ju santykinis efektas
  (itaka požymiui).

Tinkamiausias požymis salygojamas nedidelio genu
skaiciaus genu itaka- nuo vidutines iki
stiprios stipriai paveldimas (ribota aplinkos
salygu itaka)
16
Tiksliniai fenotipiniai požymiai (2)

• Tikslines miško medžiu fenotipiniu požymiu
  grupes
• Adaptaciniai požymiai (pvz. fenologija ramybes
  busena, sezoninio augimo pradžia ir pabaiga,
  ugliu medejimas).
• Reprodukciniai požymiai (pvz. lytine brada ir
  asimetrija, žydejimo gausumas, vegetatyvinis
  dauginimas).
• Medienos kokybe (pvz. bazinis tankis, chemines
  savybes, mikrofibriliu kampas).
• Atsparumas kenkejams (galima panaudoti gausia
  ž.u. kulturu patirti).
• Tokie požymiai kaip medžiu aukštis ar
  produktyvumas yra kompleksiniai (keliolikos
  požymiu grupiu saveikos išraiška), todel
  efektyviau pradžioje nustatyti šiu pirminiu
  požymiu QTL.

17
Miško medžiu QTL medžiaga (1)

• Tam, kad gauti heterozigotinius individus QTL
  tyrimams galima naudoti
• Skritingu populiaciju palikuonis. Du tolimos
  kilmes ir skirtingu adaptaciniu požymiu genotipu
  adaptaciniu požymiu lokusai bus polimorfiniai
  (skirtingi tam tikro geno aleliai), o dauguma ju
  palikuoniu heterozigotiniai.
• Rušiu hibridai. Du artimu rušiu individai yra
  genetiškai skirtingi daugumoje lokusu, todel ju
  palikuonys bus heterozigotiniai. Tikslinga
  naudoti stipriai tam tikroje rušyje išreikštu
  požymiu QTL identifikacijai (pvz. pendula genas
  Picea abies porušyje ar Pinus contorta atsparumas
  šalciui).

P. sylvestris populiaciju bandymas Lietuvoje.
Stulpeliai parodo populiaciju kilmes vietas
Egzotiniu pušu bandymas- P. sylvestris dešineje,
Pinus contorta kaireje
18
Miško medžiu QTL medžiaga (2)
Populiaciju bandymai. Tai želdiniai skirti
populiaciju genetines ivairoves, požymiu
genetinio kintamumo, paveldejimo laipsnio ir
perkelimo naudos tyrimui. Populiaciju atstovai
tolygiai išdestyti bandymo plote (sumišrinti),
kad specifiniu dirvos salygu itaka ju augimui
butu kuo mažesne.
4 raudoni tam tikros grupes individai auga beveik
visose dirvos salygose, todel ju grupes vidutines
požymiu reikšmes nebus stipriai iškraipytas
dirvos salygu skirtumu.
Pinus sylvestris tolimu populiaciju bandymas
(kilmes vietos pažymetu stulpeliais, kurie parodo
šiu populiaciju produktyvuma- aukšciau brukšnio
pranašesni už vietines.
P. egles populiaciju bandymas
19
Miško medžiu QTL medžiaga (3)
Egles populiaciju perkelimo bandymas Lietuvoje.
Populiaciju kilmes vietos pažymetos taškais.
Rezultatai genotipai ženkliai skyresi savo
adaptaciniais požymiais, priklausomai nuo kilmes
vietos temperaturos ir fotoperiodo.
AB
ab
Adaptaciniu požymiu QTL paieškoje, kryžminti
šiaurini ir pietini genotipus. Palikuonyse
dominuotu heterozigotiniai lokusai
AB
ab
QTL paieškos tyrimai
Š
P
Š-šiaurinis, P- pietinis genotipai
Taškai žymi kilmes vietas. Didesni taškai
ankstesne sezoninio augimo pradžia ir pabaiga,
mažesnis aukštis, daugiau dvistiebiu medeliu.
Šiauriniu ir pietiniu genotipu adaptaciniai
požymiai esminiai skiriasi.
20
3.3.3 QTL paieškos molekuliniu žymenu sistemos
Žymenu sistemos tikslas QTL tyrimuose yra
identifikuoti tiksliniu požymiu genus ju
paveldejimo iš tevu i palikuonis metu. Žymenu
sistemos skiriasi genu žymejimo efektyvumu ir
kaštais, kas turi esmine itaka QTL nustatymo
metodikai.
Specifinis DNR fragmentas elektroforezes gelyje
budingas tik tam tikra požymi turintiems medžiams
Palikuonys Žymuo susijes su požymiu
Polimorfine populiacija (Žymuo susijes su požymiu)
Kryžminimas (rekombinacija)
21
(No Transcript)
22
Žymenu tipai (2)
Dominantiniai žymenys negali atskirti vieno geno
alternatyviu formu (aleliu). Gali tik
identifikuoti ar genas (vienas iš aleliu) yra,
pvz. RAPD
Kodominantiniai žymenys- gali identifikuoti
alternatyvias vieno geno formas (alelius)
Žymuo N gali identifikuoti abu ankstyvos Q1 ir
velyvos augimo pradžios aleli Q2. Todel gali
atskirti heterozigotinius genotipus tikslesni,
bet sudetingesni.
Žymuo M gali identifikuoti ankstyvos augimo
pradžios aleli Q1 (bet ne jo alternatyvia forma-
velyvos augimo pradžios aleli Q2)
Q1Q1 homozigotinis ankstyvas
Q1Q2 heterozigotinis tarpinis
Q2Q2 homozigotinis velyvas
Q1Q1 homozigotinis ankstyvas
Q1Q2 heterozigotinis tarpinis
Q2Q2 homozigotinis velyvas
N
M
Q1 ir Q2 aleliai porinese chromosomose gali
skirtis tik keliais nukleotidais
Žymuo
žymuo
RFLP analizes rezultatai DNR fragmentai gelyje
RAPD analizes rezultatai DNR fragmentai gelyje
23
Žymenu tipai (3)
Dominantiniai žymenys tinka vieno motinmedžio
genu identifikacijai jo palikuoniu (pusiau sibu)
šeimoje.
Kodominantiniu žymenu reikia abieju tevu genu
identifikacijai ju palikuoniu (pilnu sibu)
šeimoje
Ar M2 susijes su Q2? Tereikia identifikuoti Q2
QTL. Tik motinmedis turi M2 ir Q2.
Ar M1 susijes su Q1 ir ar M2 susijes su Q2?
Žymenu sistema turi sugebeti atskirti Q1 ir Q2
24
Mikrosatelitai ir QTL
SSR gali buti naudojami QTL paieškoje SSR yra
kodominantiniai ir gali efektyviai identifikuoti
dideli skaiciu tam tikro geno alternatyviu formu
(aleliu) populiacijoje pagal kartotiniu seku
pakartojimu skaiciaus polimorfizma (daug ivairaus
ilgio kartotiniu seku fragmentu daug aleliniu
variantu). Esant aukštam aleliu identifikacijos
tikslumui ir tiksliniu genu formu ivairovei
(polimorfizmui) populiacijoje, yra santykinai
didesne galimybe rasti sasajas tarp šiu fragmentu
ilgio ir palikuoniu tiksliniu požymiu QTL.
25
QTL paieškos efektyvumas
QTL paieškos efektyvumas didžia dalimi priklauso
nuo bandomos medžiagos ir taikomos žymenu sistemos
Heterozigotinis genotipas (dauguma genu turi
polimorfinius alelius)
Medžiaga genetine ivairove (skirtingi genai)
dauguma požymi salygojanciu alternatyviu genu
formu (aleliu) yra skirtingi (polimorfiniai) ir
stipriai paveldimi.
Porines chromosomos
DNR
Tevine
Motinine
Žymenu sistema turetu remtis žiniomis apie
tiksliniu genu sekas (DNR tyrimai reikalauja
nemažu kaštu)
Polimorfiniai aleliai (dvi skirtingos vieno geno
formos)
Atsitiktines žymenu sistemos bando atsitiktiniu
budu aptikti gana maža DNR seku fragmenta tarp
milijono kitu seku
Pagrindinio ar su juo susijusiu genu dalies seku
žinojimas ženkliai padidintu žymenu paieškos
efektyvuma
Monomorfiniai aleliai (dvi vienodos vieno geno
formos)
5 genai salygojantys viena požymi (didesni turi
svaresne itaka)
26
Miško medžiu QTL žymenys

• Naudojant atsitiktines žymenu sistemas, tikimybe
  aptikti QTL žymenis nedidele (neefektyvu),
• Išeitis- paruošti žymenis pagal tam tikrose
  salygose išreikštu polimorfiniu genu daliu
  kopijas (EST žymenys).
• Principas vieno genotipo kopijos auginamos
  skirtinguose, tam tikro geno išraiška
  skatinanciose salygose izoliuojama
  iRNR?cDNR-AFLP skirtingu cDNR identifikacijai,
  žymenu kurimas iš polimorfiniu cDNR daliu)

klonai
klonai
klonai
27
Neutralus ir išreikšti žymenys
Kadangi didžioji dalis genomo sudaryta iš
nekoduojamos DNR(95), dauguma tradiciniu žymenu
sistemu žymi nekoduojamas sekas, kurios
nepriklausomos nuo atrankos (žymenys neutralus
atrankai)
Žymenu sistemos pasirinkimas priklauso nuo tyrimo
tikslo Neutralus žymenys tinkamiausi siekiant
ivertinti genetine ivairove ar atrankai neutraliu
požymiu QTL. Ieškant adaptaciniu požymiu QTL,
išreikštus genus identifikuojantys žymenys yra
pranašesni (atsitiktine paieška
neefektyvi). Išreikšti žymenys EST, cDNR-AFLP
neutralus pvz. RFLP, RAPD, AFLP
Genomine DNR (visu chromosomu DNR laisvoje
formoje) dalys kur yra aktyvus genai sudaro tik
15 proc (storos atkarpos paveiksle).
Sekvenuoto Populus genomo dydis- 500 mln. bp,
Eucalyptus 340-580 mln bp, Pinus 25 000 mln. bp
28
Specialiu žymenu kurimas (1)

• Genu ekspresijos bandymas vieno genotipo kopijos
  skirtingose salygose.
• iRNR izoliacija ir kopijavimas i cDNR (klonavimas
  plazmidese),
• AFLP analize polimorfiniu cDNR identifikacija,
• Polimorfiniu cDNR bangu izoliavimas gelyje ir
  sekvenavimas,
• (a) Žymenu pažyminciu tikslinius ar susijusius
  genus kurimas,
• (b) cDNR atitikmenu paieška DNR mikroseku metodu,
  genu bibliotekose siekiant nusakyti kandidatinius
  genus.
• Žymenu testavimas ir naudojimas QTL paieškoje
  (pagrinde SNP ir EST žymenys).

29
Specialiu žymenu kurimas (2)
cDNRAFLPEST metodas tikslas identifikuoti
tam tikrose aplinkose išreikštus genus ir iš ju
pagaminti žymenis, taikomus ivairiose žymenu
sistemose.
1. Tam tikroje aplinkoje auginamu genotipu iRNR
izoliavimas iš audiniu, kuriuose tiksliniai genai
yra išreikšti (pvz. pumpuras, jei tiriami pumpuru
ramybes busenos genai).
2. Komplimentarios DNR (cDNR) sintetinimas pagal
iRNR kopijas ir cDNR sukarpymas dvieju skirtingu
restriktaziu pagalba (viena dažnai, kita retai
kerpanti).
3. DNR fragmentu galu jungimosi neutralizavimas
prijungiant adapterius (pagal restriktaziu sekas)
4a. PCR 1 ciklas naudojami 2 pradmenys (sekos
restriktaziu atpažistamos sekos 1 nukleotidas).
Atrenkami pradu sekoms tinkantys fragmentai.
4b. PCR 2 ciklas 2 nauji pradmenys (sekos
restriktazes sekos 1 2 ar gt nauju nukleotidu).
Rezultate atrenkami tam tikri fragmentai
5. Elektroforezes gelyje bus matomi po 2-ju
atrankos ciklu pateke DNR fragmentai.
Polimorfiniai fragmentai- tai bandomose salygose
išreikšto geno dalys (genotipai identiški,
skirtumas tik aplinkos salygose, kurios itakavo
skirtingu genu išraiška). Šie fragmentai
izoliuojami iš gelio ir sekvenuojami tolesniam
išbandymui.
30
Specialiu žymenu kurimas (3)
6. cDNR izoliavimas ir klonavimas
7. cDNR sekvenavimas
Restriktazes
Rekombinuotos plazmides
cDNR fragmentu identifikacija nukleotidu seku
nustatymas automatiniuose sekvenatoriuose
cDNR
cDNR
Bakterijos
Gelis
cDNR
Elektroforezes gelyje izoliuoti polimorfiniai
cDNR fragmentai (išreikštu genu dalys) iterpiami
i bakteriju plazmides (patogiau atlikti tolesnius
sekvenavimo darbus)
Žymenu kurimas ir testavimas
8. Atitikmenu paieška.
Seku lyginimas duomenu bazese
9. Testavimas bandymuose.
DNR mikroseku bibliotekose
www.ncbi.nlm.nih.gov
pagrinde EST, SNP, STS žymenys (RFLP markeriai ir
PCR pradai),
Prieš bandant cDNR fragmentus kaip žymenis,
bandoma nustatyti ju seku atitikmenis su jau
rastais genais ar žymenismi duomenu bazese ar DNR
mikroseku bibliotekose (hibridizacija su žinomais
genais)
10. Rezultatas- kandidatiniai genai
31
Specialiu žymenu kurimas (4)
AFLP detales adapteriu prijungimo, PCR pradmenu
gamybos ir DNR pagausino principai
1. DNR sukarpymas 2 skirtingomis restriktazemis,
2. Adapteriu prijungimas (lipniu fragmentu
galu neutralizavimas), 3a. Pirmas PCR ciklas
pradmuo restriktazes atpažistama seka 1 naujas
nukleotidas PCR pagausinimas tik tam tikru
fragmentu, turinciu nauja nukleotida po
restriktazes sekos. 3b. Antras PCR ciklas
specialiu pradmenu gamyba- restriktazes seka 1
2 nukleotidai PCR amplifikacija (tam tikru
fragmentu atranka)
32
Specialiu žymenu kurimas (5)
Bandymas klimatineje kameroje. Tikslas rasti
žymenis susijusius su augimo pabaigos QTL.
Metodai Du to paties genotipo klonai auginami
skirtingose salygose ir išreikštu genu
identifikacija pagal cDNR-AFLP analize.
Augimo salygu imitacija
Augimo pabaigos imitacija
Pumpuru krovimo pradžios stadijoje iš pumpuru
izoliuojama iRNR
Šviesa, 20C
Tamsa, 10 C
cDNR sintetinamas ir sukarpymas restriktazemis
Adapteriu prijungimas
PCR 1 ciklas (pradmenys1 nukleotidas)
PCR 2 ciklas (pradmenys2 ir gt nukleotidai)
Elektroforeze, polimorfiniu bangu izoliavimas ir
žymenu kurimas
Rezultatas gauti skirtingi iš viršuniniu
meristemu izoliuotos iRNR fragmentai galimos
atsakingu genu (QTL) dalys reikalingas tolesnis
patikrinimas tyrimais
33
Specialiu žymenu kurimas (5)
Bandymo klimatineje kameroje pavyzdys. Tikslas
ivertinti p. egles genotipu tolerancija šalcio
sausrai vienas genotipu rinkinys laikytas 1-2
savaites su užšaldytomis šaknimis po intensyvia
šviesa (pažeidimo pobudis intensyvi šviesa
garinamas vanduo, o užsalusios šaknys
nekompensuoja vandens netekties džiuvimas),
kitas tu paciu genotipu rinkinys optimaliose
augimui salygose. Nuotraukoje vonios pripildytos
gliukolio (-3C) intensyvioje šviesoje.
34
cDNR pritaikymas žymenu sistemose

• EST žymenu gamyba EST tai 200-500 bp ilgio
  polimorfiniu cDNR fragmentu dalys, žymincios cDNR
  pradžia ir pabaiga (PCR pradai ar markeriai
  hibridizacijai DNR gardelese ir RFLP sistemoje)
• EST savo ruožtu naudojami SNP (pavieniu
  nukleotidu polimorfizmo atkarpu) žymenu paieškai
• DNR mikrosekose - gena identifikuojancios dalys.
• RFLP markeriai hibridizacijai ilgis100 bp
  (polimorfiniai cDNR fragmentai) -1500 bp
  (identifikuoti nedideli genai)
• Pradai žymintys unikaliu seku atkarpas (STS) (SSR
  ar ISSR pradai specifines DNR atkarpos,
  juosiancios 2-3 bp (1-10 bp) dydžio seku
  pasikartojimo regionus DNR molekuleje)

35
Genomines duomenu bazes
Puiki išeitis žymenu sistemu analizes
optimizavimui (markeriu , adapteriu pradu seku
paieška).
Nacionalinio biotechnologiju centro duomenu
bazes cDNR ar EST sekos
Augalu genomo duomenu baze RFLP markeriai tam
tikro geno hibridizacijai (kukuruzas)
36
EST sukurimas

• Genotipai bandomi tam tikroje aplinkoje.
• Iš specifiniu audiniu, kuriuose vyksta atsakas i
  stresa, izoliuojama iRNR (geno kopijos), iš ju
  sintetinamos stabilesnes cDNR molekules.
• Atsitiktiniu budu atrankos cDNR dalinai
  sekvenuojamos ir lyginamos su cDNR bibliotekose
  esanciomis žinomos funkcijos cDNR sekomis
• Nustacius atitinkamus, pagaminami EST žymenys
  identifikuojanti tam tikra gena.
• EST žymenys naudojami QTL testavimui ir
  kandidatiniu genu paieškos tymuose.

37
Žymenu sistemos santrauka

• RFLP () tiksli , kodominantine, (-) reikalauja
  daug darbo, nemažo DNR kiekio, ir darbo su
  radioaktyviomis medžiagomis.
• RAPD () nedaug DNR (tinka seklu analizems),
  pigus, greitas (-) dominantinis ir mažiau
  tikslus patobulinimas- AFLP (RFLP ir PCR
  kombinacija tikslesnis, vis tiek dominantinis),
• Eile PCR ir restriktaziu panaudojimu pagristu
  nauju sistemu, kurios skiriasi tuo kaip gaunami
  PCR pradai ar markeriai identifikacijai
  (kodominantiniai, tikslus)
• EST, SCAR, STS, SNP (pradu sekos iš cDNR
  biblioteku ar genu ekspresijos tyrimu, iš
  genomines DNR biblioteku ir polimorfiniu RAPD
  fragmentu)
• Efektyvus miško medžiu žymenu generavimo budas-
  genu seku duomenu baziu analize ar genu
  ekspresijos tyrimai ir DNR mikrogardeliu
  panaudojimas

38
3.3.4. QTL nustatymo statistiniai metodai

• Statistiniu metodu tikslas nustatyti potencialaus
  QTL žymens ir požymio ryšio esminguma ir QTL
  žymens itaka fenotipinio požymio išraiškai.
• Paversti DNR fragmentu buvima gelyje i skaicius
  (0- nera, 1- yra) ir suskirstyti palikuoniu
  fenotipiniu požymiu vertes pagal kiekvieno
  fragmento buvimo ir nebuvimo klases (pagal žymenu
  genotipus).
• Kiekvienam fragmentui (potencialiam žymeniui),
  palyginti palikuoniu fenotipinio požymio
  vidurkius tarp tarp žymenu genotipu (t.y.
  nustatyti pvz. palikuoniu aukšcio skirtumus tarp
  M1M1 ir M2M2 (kodominantinis žymuo) ar tarp
  turinciu ir neturinciu M fragmento palikuoniu
  (dominantinis žymuo)
• ANOVA, t-testas, regresija (kodais išreikštu
  žymenu genotipu sasaja su požymio fenotipu),
• Chi-kvadrato testas (kategoriniai kintamieji).
• Jei skirtumai esminiai- žymuo susijes su
  atitinkamo požymio QTL skirtumo tarp vidurkiu
  esmingumas žymens sasajos su QTL stiprumo
  rodiklis.
• Jei yra daugiau nei vienas potencialus žymuo
  (žymenu polimorfizmas gelyje), naudojamas
  intervalu interpoliacijos (maksimalios tikimybes)
  metodas (Maximum Likelihood-Lander Botstein,
  1989), alternatyva Composite Interval Mapping
  (Linked markers-Zeng, 1993).

39
Duomenu paruošimas
DNR fragmentu (bangu) buvimas gelyje paverciamas
i 0 ir 1 duomenu masyva pagal fragmentu dydi ir
požymio išraiškos vieneta.
Genotipu , turinciu tam tikro ilgio DNR fragmenta
skaicius () kiekvienoje žieves formos klaseje
DNR fragmento dydis (bp)
DNR fragmento dydis (bp)
Palikuonys
Fragmentu dydžio skale
40
Žymens ir požymio ryšys (1)
Tikslas rasti žymenis, susijusius su sezoninio
augimo pradžios QTL
Tevine populiacija polimorfizmas augimo pradžios
laike, pvz., provenenciju bandymas QTL genotipu
požymiai Q1Q1 homozigotinis, ankstyva pradžia
Q1Q2 heterozigotinis, tarpinis Q2Q2
homozigotinis, velyvas.
RFLP gelis
Kryžminimui parenkami tevai ankstyvas (Q1Q1),
tarpinis (Q1Q2), atliekami ju DNR tyrimai (pvz.
RFLP), kur žymuo M1 susijes su Q1 (ankstyvas), o
M2 susijes su Q2 (velyvas).
Polimorfinio žymens lokusas
M
M
Kiti lokusai
Motina
Tevas
Žymuo
Jei M žymuo susijes su augimo pradžios QTL, tai
po rekombinacijos palikuonys tik su M1 žymeniu
bus ankstyvi, o su M1M2 tarpiniai.
QTL
41
Žymens ir požymio ryšys (2)

1. Atliekami palikuoniu DNR tyrimai RFLP metodu
   nustatomas palikuoniu RFLP genotipas (M1M1 ar
   M1M2)
2. Lauko bandyme nustatomas palikuoniu RFLP genotipu
   augimo pradžios laikas (fenotipas QTL
   indikatorius)

Yij µ Mi ?ij
3. ANOVA pagalba lyginamas RFLP genotipu
vidutinis augimo pradžios laikas jei skirtumas
esminis- M žymuo susijes su augimo pradžios QTL
skirtumo esmingumas sasajos stiprumas
Palikuonio Nr.
Žymuo
M
100
400
fragmento dydis (bp)
Skirtumas esminis, plt0,05, R278
Skirtumas neesminis R28
()
Velai
1200
Augimo pradžia
2000
RFLP genotipas
Anksti
M1M1
M1M1
M1M1
M1M2
M1M2
M1M2
M1M1
Žymens M RFLP genotipai
Žymens M RFLP genotipai
Fenotipas lauko bandyme
Tarpinis
Tarpinis
Tarpinis
Ankstyvas
Alternatyva 1 M žymuo susijes su augimo pradžios
QTL, sasajos stiprumas R278
Alternatyva 2 M žymuo nesusijes su augimo
pradžios QTL (atskirti rekombinacijos)
Ankstyvas
42
Žymens ir požymio ryšys (3)
Vertinant kelis žymenu lokusus (polimorfiniai DNR
fragmentai gelyje) ANOVA žymenu sasajai,
Maksimalios tikimybes algoritmas- atrankai tarp
žymenu
1. RFLP gelis
3. Tinkamiausio žymens nustatymas pagal skirtumo
dydi
Maksimali QTL tikimybe tarp žymenu M ir N
Skirtumo esmingumas pvz. F reikšme
Riba kai sasajos nera
Rezultatai sankabos grupiu žemelapyje, kur
atstumai tarp žymenu (a) rekombinaciju tarp
žymenu
a2
a3
a1
R (11)
M (78)
N (41)
P (25)
43
Žymens ir požymio ryšys (4)
Kategoriniams kintamiesiems tinka Chi-kvadrato
testas, t.y. kai fenotipinis požymis vertinamas
keliomis klasemis (pvz. žieves forma) tikrinama
ar sasaja tarp kiekvieno DNR fragmento ir žieves
formos yra atsitiktine. Neatsitiktine sasaja
parodo genotipu, turinciu tam tikra DNR
fragmenta, skaiciaus skirtumas tarp atskiru
požymio klasiu.
Chi-kvadrato testas naudojamas nustatyti ar yra
esminis nukrypimas nuo atsitiktinio DNR fragmentu
pasiskirstymo atskirose žieves formos klasese?
Skirtumo esmingumas QTL ir žymens sasajos
stiprumas
44
Žymens ir požymio ryšys (5)
Dominantinio žymens atveju, atliekama ANOVA, kur
ivertimas fenotipinio požymio skirtumo esmingumas
tarp palikuoniu su žymeniu ir be žymens.
Dvieju žymenu identifikacijos atvejis (M1 lygi,
M2 supleišejusi žieve). Genotipas M1-M1
fenotipas (lygi žieve) (A tipas nuotraukoje),
M1-M2 tarpine (B) ir M2-M2 supleišejusi (C).
Skirtumai tarp žieves klases vidurkiu nustatomi
ANOVA ar t-testu
M1 lygi žieve (A forma nuotraukoje) M1 ir M2
tarpine žieve (B forma nuotraukoje) M2
supleišejusi žieve (C forma nuotraukoje)
100
M1
400
DNR fragmento dydis (bp)
M2
1200
2000
A
B
C
Jei skirtumai esminiai potencialus QTL
žymuo Skirtumu esmingumas sasajos su QTL
stiprumas
26 medžiai 54 medžiu 23 medžiai
45
Žymens ir požymio ryšys (6)

• Tam, kad gauti pakankama individu skaiciu sasajos
  analizei reikalingas pakankamas šeimos palikuoniu
  skaiciaus.
• Pavyzdžiui, dispersines analizes patikimumas,
  lyginant 2 medžiu grupiu skirtumo esminguma,
  priklauso nuo medžiu skaiciaus grupese
  paprastai, lyginant miško medžiu kiekybinius
  požymius, grupiu skaicius turetu buti nemažesnis
  nei 20 (priklauso nuo požymio dispersijos).
• Todel lyginant vieno žymens genotipus, reiketu
  apie 40 palikuoniu (2020)

Medžiu skaicius kiekvienoje žymens genotipo
grupeje

• Tiketina, kad dauguma QTL paieškos žymenu sistemu
  produktuos 3-4 polimorfinius (potencialius) QTL
  žymenis, todel apytikris minimalus QTL nustatymo
  populiacijos dydis gt 100 individu

Viso
20 20
120 palikuoniu
20 20
20 20
N1N1 N2N2
P1P1 P2P2
R1R1 R2R2
Žymens N genotipai
Žymens P genotipai
Žymens R genotipai
46
Žymens itakos nustatymas
Su žymeniu susijusio QTL itaka požymiui nustatoma
lyginant žymens genotipu fenotipinio požymio
skirtuma su kitu žymenu genotipu skirtumais Pvz.
M žymens genotipu (M1M1 ir M2M2) skirtumas
pakeltas kvadratu / iš kitu žymenu genotipu
skirtumu kvadratines sumos.
M itaka Gm2 / suma(Gi2)
77 / ((44)(66)(33)) (49 /61)100 80
Maksimali QTL tikimybe tarp žymenu M ir N
Augimo pradžios skirtumas, dienomis
1 2 3 4 5 6 7 8
Riba kai sasajos nera
a2
a3
a1
R
M (80)
N
P
Žymenu išdestymas sankabos grupeje (cM)
47
Intervaline interpoliacija
Jei yra keli QTL žymenys, tinkamiausias
nustatomas Maksimalios tikimybes1 metodu
kiekvienam žymeniui paskaiciuojant LOD rodikli,
kuris pagrinde išreiškia rekombinacijos tarp
žymens ir QTL dažni, dažnius paverciant
tikimybemis.
LOD log (Ty sasaja yra/ Tn kad sasaja
atsitiktine), kur
Tikimybe (Ty) Prop(nerekomb)n Prop(rekomb)m,
kur n ir m nerekombinantu ir rekombinantu
skaicius, Prop proporcija.
Tikimybe (Tn) 0.5 nm
Maksimali QTL tikimybe netoli nuo M žymens LOD
interpoliacijos rezultatas
LOD rodiklis leidžia palyginti skirtingus žymenis
ir požymius
LOD reikšmes
Riba kai sasajos nera LODlt3
a2
a3
a1
R
M
N
P
1-Lander Botstein, 1989
Žymenu išdestymas sankabos grupeje (cM)
LOD- logarythm of odds ratio
48
QTL nustatymo efektyvumo padidinimas (1)
Palikuoniu klonavimas

• Fenotipiniu požymiu ivertinimo tikslumo
  padidinimas (vietoje vieno fenotipo išbandome
  keliolika jo kopiju tiksliau nustatomas
  fenotipinio požymio genetinis salygotumas)
• DNR tyrimams reikalingu individu skaiciaus
  sumažinimas mažesni kaštai.

49
QTL nustatymo efektyvumo padidinimas (2)
Atrankinis genotipavimas- tik atrinktu palikuoniu
genotipu DNR analize (ang. selective genotyping).

• Pasirenkami palikuonys su ekstremaliomis
  fenotipinio požymio reikšmemis, siekiant
  padidinti QTL aptikimo tikimybe.
• DNR tyrimams reikalingu individu skaiciaus
  sumažinimas mažesni kaštai.

Palikuonys Išbandomi
Ekstremaliu fenotipu (pvz. aukštas ir žemas
medis) atranka lauko bandymuose DNR žymenu
identifikacijai
50
QTL nustatymo efektyvumo padidinimas (3)
Grupinis genotipavimas- atrinktu genotipu mišinio
DNR analize (ang. bulk segregant analysis).

• Siekiant padidinti QTL aptikimo tikimybe,
  pasirenkami palikuonys su ekstremaliomis
  fenotipinio požymio reikšmemis
• Ju DNR apjungiama ir analizuojama atskirai.
• DNR tyrimams reikalingu individu skaiciaus
  sumažinimas mažesni kaštai.

DNR apjungiama
DNR apjungiama
Aukštu medžiu DNR
Žemu medžiu DNR
Ekstremalus fenotipai atrenkami lauko bandymuose,
ju DNR pavydžiai apjungiami ir naudojami žymenu
ir požymio sasaju tyrime
51
QTL nustatymo statistiniai metodai (sankibos
grupiu žemelapiai)

• Kiekybinis požymis gali buti salygojamas
  keliolikos genu,
• Sudaromi genus žyminciu žymenu sasajos su ju QTL
  žemelapiai (sankibos grupiu žemelapiai kiekvienai
  žymenu kategorijai)
• Tam tikru QTL žymenys išdestomi žemelapiuose, kur
  atstumas tarp dvieju žymenu išreiškiamas pagal
  tai kaip dažnai jie paveldimi vienoje sukibimo
  grupeje
• Rekombinacijos tarp dvieju žymenu dažnis
  išreiškiamas centimorganais (cM)
  rekombinantiniu genotipu (žymenys buvo atskirti
  rekombinacijos metu) procentas.
• Vienoje sankibos grupeje esantys žymenys
  atitinka viena chromosoma

Sankibos grupe Nr.1. SSR žymenu sistema
52
Nustacius QTL tolesni žingsniai

• Nustacius QTL tolesni žingsniai
• QTL testavimas (tikrinimas)
• Kandidatiniu genu identifikacija ir tai
  alternatyviu geno/QTL formu (aleliu paieška)

Tam reikalingos tikslias nukleotidu sekas
atpažistancios žymenu sistemos

• Gausiu cDNR ir EST seku duomenu baziu efektyvus
  panaudojimas

• EST žymenys genu izoliavimui ir klonavimui.
• EST genu polimorfizmo nustatymas pavieniu
  nukleotidu polimorfizmo (SNP) ar DNR mikro seku
  metodais.

53
3.3.5 QTL testavimas

• Efektyviam QTL panaudojimui selekcijoje,
  reikalingas QTL patikrinimas skirtingose
  aplinkose, skirtingu laiku (skirtingame amžiuje)
  ir naudojant skirtingas genetines linijas
  (šeimas).
• Be šiu testavimo tyrimu, QTL tinkami naudoti tik
  toje aplinkoje ir su ta šeima, su kuriais jie
  buvau gauti.

Ar tie patys QTL bus gauti išbandant tuos pacius
genotipus skirtingose aplinkose keliu augimo
periodu metu?
Ar tie patys QTL (požymio ir žymenu sasajos) bus
gauti su skirtingais teviniais genotipais?
54

• Jei testavimo bandymo metu QTL nebuvo
  pakartotinai gauti, priežastis gali buti per
  mažas QTL populiacijos dydis, todel QTL
  nustatymui reikalingos didesnes palikuoniu
  populiacijos (ypac mažos itakos QTL nustatymui).
• Pageidautinas mažesnis požymiu kompleksiškumas
  pvz. vietoje aukšcio vertinti fenologinius
  požymius ir fotosintetini potenciala.
• Nepriklausomu tyrimu rezultatai turi buti irašomi
  i bendrus tam tikrai rušiai genolapius
  (palyginamieji genolapiai)
• Pavyzdys Eucalyptus grandis- keli nepriklausomi
  tyrimai su skirtingomis šeimomis aptiko medienos
  bazinio tankio QTL homologinese sankibos grupese
  (Grattapagia ir kt. 1996, Verhaegen ir kt. 1997).

QTL identifikacijai naudingas požymiu išskaidymas
siekiant prieiti kaip galima arciau prie
tiesiogiai požymi salygojanciu genu. Pavyzdys
dešineje genotipo aukštis priklauso nuo jo
sezoninio augimo trukmes velesne augimo
pabaigailgesnis augimo laikas didesnis aukštis.
Todel pravartu ieškoti sasaju tarp žymenu ir
augimo pabaigtos laiko, o ne medeliu aukšcio.
55
3.3.6 Miško medžiu QTL identifikacijos rezultatai

• Tiksliniai požymiai
• Adaptaciniai požymiai (fenologija, tolerancija
  šalciui, sausrai)
• Reprodukciniai požymiai (lytine branda, žydejimo
  gausumas, lytine asimetrija),
• Atsparumas ligoms ir kenkejams (tolerancija
  aliuminiui)
• Medienos kokybe (bazinis tankis, stiebo suktumas,
  gravitaciniai požymiai, chemines savybes
  (celiuliozes išeiga))
• Kiti požymiai (pvz. egles pendula forma, lapu
  požymiai, stiebo tiesumas, H, D, šaknydamosi
  energija, dauginimosi gyvašakemis geba)

56

• Rušys (eiles tvarka) Eukaliptas, Populus gentis,
  pietines pušys, P. egle, p. pušis, pocuge.
• Pagrinde naudotos selekciniu populiaciju remuose
  sukurtos sibu šeimos atbuline seka nuo
  palikuoniu link tevu.
• Naudos žymenu sistemos pradedant nuo RAPD, RFLP,
  AFLP, SSR, dabartiniu metu cDNA-AFLP, EST, SNP.
• Efektyvi tolimu populiaciju ir artimu rušiu
  hibridizacija.
• Pastaba tokie požymiai kaip aukštis yra
  išvestiniai, keliu kitu kiekybiniu požymiu
  išdava, todel efektyviau sumažinti požymi
  itakojanciu genu grupiu skaiciu (kompleksiškuma)
  ir ieškoti tiesioginiu genu grupiu QTL.

57
Spygliuociu miško medžiu rušyse rasti QTL
(tipiniai pavydžiai)
58
Lapuociu miško medžiu rušyse rasti QTL (tipiniai
pavydžiai)
59
QTL rezultatai irašomi i genolapius

• Populus sankibos grupiu genolapis kiekybinius
  požymius lemia vienu metu daug genu (QTL),
  išsidesciusiu daugelyje chromosomu vietu (medžiu
  aukšcio QTL pažymeti raudonai)

60
MAS ir QTL tyrimu pasiskirstymas pagal medžiu
gentis (FAO 2004)
61
MAS ir QTL tyrimu pasiskirstymas pagal požymius
(FAO 2004)
62

• Reprodukciniai požymiai (naudingi selekcijai)
• Lytine branda,
• Žydejimo gausumas
• Lytine asimetrija (vyrišku ir moterišku žiedu
  santykis)
• Ugliu šaknydamosi geba

Picea abies moteriškas strobilas
Reprodukciniu požymio pavyzdys lytine branda.
Seklines kilmes paprastosios pušies genotipas
pasiekes lytine branda 9 metu amžiuje (paprastai
pasiekiam 15-20 m). Nuotraukoje matomi vyriški ir
moteriški strobilai (netikri žiedai).
63

• Adaptaciniai požymiai tai požymiai turintys
  esmine itaka individu išlikimui (tuo paciu
  ekonominei naudai).
• Šiaureje vieni iš svarbiausiu yra fenologiniai
  požymiai ir su jais suejusi tolerancija šalciui
  ir šalnu išvengimas, pietose- tolerancija sausrai.

Fenologiniai požymiai tai medžio fiziologiniu
busenu kitimo laikas metu begyje (augimo pradžia
ir pabaiga, ramybes busena, ugliu sumedejimo
lapsnis, ramybes busenos praradimas)
a) anksti pradejes sezonini augima šiaurines
Lietuvos p. egles genotipas pakenktas pavasariniu
šalnu b) iš šaltesnio klimato atkelti p. egles
genotipo pradeda augima anksciau nei vietiniai.
b)
a)
64

• Medienos kokybes požymiai (naudingi selekcijai)
• Medienos bazinis tankis (kietumas)
• Tracheidžiu ilgis, mikrofibriliu kampas
• Celiuliozes išeiga
• Chemines savybes

Tracheidžiu ilgis
Medienos Bazinis tankis priklauso nuo lasteliu
sieneles storio velyvos medienos (formuojamos
augimo sezono pabaigoje) lasteliu sieneles yra
storesnes
Mikrofibriliu kampas- vidutinis celiuliozes
molekuliu kampas lasteles sienleje
65
Rezultatu apibendrinimas

• Rezultatus galima sisteminti pagal tokius
  kriterijus
• Požymi salygojanciu QTL skaicius ir QTL itakos
  stiprumas (kiek QTL salygoja požymi ir kokia QTL
  itaka požymio išraiškai?),
• Ivairiu požymiu QTL išsidestymas genome
  (chromosomose) (ar panašiu požymiu QTL yra netoli
  vienas kito?),
• QTL išraiškos stabilumas (ar pakartojus tyrima su
  ta pacia medžiaga bus gauti tie patys QTL?).

66
Požymio QTL skaicius ir itaka

• Nors teoriškai kiekybiniai požymiai salygojami
  daugelio geno, rastas stebetinai mažas tam tikro
  požymio QTL skaicius (vidurkis 2,7 QTL per
  požymi)
• QTL salygotas fenotipinio požymio kintamumo
  procentas vyravo nuo 4 iki 63 pagrinde rasta
  nedaug bet svarios itakos QTL,
• Daugumai poligeniniu požymiu tokias išvadas sunku
  pritaikyti,
• Priežastis salyginai mažos (lt150) palikuoniu QTL
  tyrimo populiacijos (del aukštu DNR tyrimu
  kaštu) buvo aptiktas mažesnis QTL skaicius nei
  iš tikruju bei ju itaka fenotipiniams požymiams
  gauta didesne nei iš tikruju
• Todel, galutines išvados del QTL skaiciaus ir
  itakos darytinos tik po tolesniu QTL testavimo
  tyrimu

Apibendrinimas paveiksle tam tikra požymi
salygojantys QTL ir ju itaka fenotipiniam požymiui
Nustatytas tyrimais QTL skaicius
Tiketinas QTL skaicius
67
QTL išsidestymas chromosomose

• Principas ta pati QTL nustatymo populiacija
  tiriama skirtingais žymenimis ir vertinami
  ivairus fenotipiniai požymiai
• Rezultatai
• Pagrinde, fenotipiškai susijusiu požymiu QTL buvo
  vienodose ar netolimose sankibos grupese
• Jei QTL itaka vienoda vienas genas koduoja
  baltyma, kuris yra nors ir nevienodai bet
  reikalingas abiem požymiams,
• Jei QTL itaka skirtinga du susije genai ar kita
  bet susijusi požymi salygojantys genai.
• Jei fenotipiškai nesusijusiu požymiu QTL buvo
  susije pleotropija- vienas genas itakoja kelis
  požymius.
• Pavydžiai Eucalyptus (lapo plotas-H medienos
  kietumas-stiebo suktumas-žieves mase), Castanea
  (ugliu plaukuotumas-stiebo spalva) Populus
  (ivairus lapu požymiai)

68
QTL išraiškos stabilumas (1)

• QTL aptikimas ir išreikštumas priklauso nuo
  laiko, aplinkos ir genetiniu faktoriu
• Laiko faktoriai genai ijungiami tam tikrame
  medžiu ontogenezes etape (pvz. lytines branda)
• Aplinkos faktoriai aplinka inicijuoja tam tikru
  genu ijungima (pvz. pumpuru ramybes busena ar
  sezoninio augimo pradžia)
• Genetiniai faktoriai kai kurie QTL budingi tik
  tam tikrai šeimai todel vertingiausia QTL
  aptikti keliose šeimose
• Stiprios itakos QTL greiciausiai yra genai
  ijungejai, priimantys aplinkos signalus ir
  inicijuojantys kitu genu grupiu veikla (pvz.
  sezoniniai medžiu fiziologines busenos pokyciai)

69
QTL išraiškos stabilumas (2)

• QTL nebuvo pakartotinai aptikti vienoje QTL
  populiacijoje
• Aukštis (H) ir skersmuo (D) keliu augimo periodu
  (AP) metu (Populus, Pinus taeda),
• Priežastys vieno AP metu aptikti susijusiu
  požymiu QTL, kurie del kitokiu aplinkos salygu ar
  fiziologines busenos buvo kitaip išreikšti ir
  turejo kitokias sasajas su medžiu H ir D kito AP
  metu ( reikalinga mažiau kompleksiniu požymiu
  analize, pvz. augimo ritmas vietoje aukšcio)
• Buvo aptikti keliu augimo periodu metu
• Lapu demetlige (Populus), jaunu sejinuku aukštis
  (Pinus pinaster), medienos tankis (Eucalyptus,
  Pinus taeda), pumpuru sprogimas (Pseudotsuga
  menziesi)
• Išvada didesnis QTL stabilumas rastas
  adaptaciniams požymiams (priežastis aukštesnis
  paveldimumas) ir rezistentiškumo kenkejams
  požymiams (mažesnis kompleksiškumas).
• Patikima strategija kandidatiniu genu paieška ir
  ju STS ar EST žymenu gamyba ir naudojamas
  selekcijoje

70
QTL išraiškos stabilumas (3)

• Požymio ir QTL sasaja gali žymeti ir su tuo
  požymiu susijusiu kitu požymiu QTL
• Pavyzdžiui kadangi medžiu medienos bazinis
  tankis (medienos kietumas) yra susijes su ju
  sezoninio augimo pabaigos laiku, QTL susijes su
  medienos kietumu gali buti ir genu atsakingu už
  augimo terminacija dalis.
• Metine rieve susideda iš ankstyvosios (minkštos)
  ir velyvosios (kietos) medienos.
• Augimui i aukšti pasibaigus, medis tebeauga i
  skersmeni, suformuodamas velyvaja mediena kuo
  ankstesne augimo pabaiga tuo daugiau formuojama
  kietesnes velyvosios medienos.

Perkelti i pietus, šiauriniai genotipai sustoja
augti i H anksciau, todel priaugina lt minkštos
ankstyvos medienos ir gt velyvos (kietos)
medienos.
71
3.3.7 Kandidatiniu genu paieška

• Tikslas sumažinti atstuma tarp žymenu ir QTL bei
  identifikuoti QTL genus.
• Kandidatiniai genai tai sekvenuoti genai, kurie
  gali itakoti požymio išraiška (t.y. genai
  salygojantys tikslius biocheminiu procesus, pvz.
  enzimas kanalizuojantis lignino monomeru
  jungtis).
• Potencialus kandidatiniai genai gali buti
  identifikuojami panaudojant žinomus QTL žymenis
  ir specifiniu audiniu cDNR bibliotekas bei
  naudojant tinkamas cDNR sekas kaip geno žymenis
• iprastinese QTL analizese, geno efektui
  nustatyti.
• alternatyviu aleliu sasaju su požymiais tyrimus
  klonu archyvuose ar kitose polimorfinese
  populiacijose pagrindiniu genu (t.y. genu, kuriu
  polimorfizmas turi esmine itaka fenotipui)
  paieška.

72
Pagrindiniai paieškos principai
1. Kandidatinius genus žyminciu žymenu kurimas
genu ekspresijos tyrimas ? polimorfiniu cDNR
identifikacija ? seku nustatymas ? atitikmenu
paieška bibliotekose ? gena žyminciu žymenu
kurimas (EST ar STS)
cDNR atitinkanciu genu paieška bibliotekose
Polimorfiniu cDNR nusatymas
Specifines sekos žymincios abi geno puses
naudojamos kaip žymenys
Sekvenavimas
cDNR
GTATAGGTCTCTGT
Kandidatinio geno seka
2. Kandidatinius genus žyminciu žymenu naudojimas
geno ir požymio sasajai patikrinti ir
polimorfiniu geno formu (aleliu identifikacijai)
Žymenu naudojimas geno patikrinimui (geno sasajos
su fenotipiniu požymiu patikrinimas) ir
polimorfizmo studijos
Alternatyvios vieno geno formos (aleliai) galai
skirtis tik keliais nukleotidais identifikavus
QTL žinoma tik viena iš šio geno formu
keliu populiaciju ir keliolikos šeimu bandymai
73
Klonu archyvas aleliu kasykla
Klonu archyvai (genotipu kopiju kolekcijos) ir
tolimu populiaciju bandymai gali tarnauti kaip
puiki medžiaga ivairiu žinomo geno formu aleliu
identifikacijai. Kadangi šiuose bandymuos
sukaupta nemaža dalis rušiai atstovaujancios
genetines ivairoves.
Žinant geno sekas (ar jo dalies sekas iš EST
biblioteku) šie archyvai gali buti naudojami kaip
alternatyviu šio geno formu (aleliu) kasyklos
Pinus sylvestris klonu archyvas
74
SNP žymenu taikymas (1)

• SNP ir juos žymincios specifines gretimos DNR
  nukleotidu atkarpos randamos
• a) sekvenuojant polimorfinius PCR fragmentus,
  pagausintus naudojant EST žymenis polimorfinese
  populiacijose (kilmes, klonu archyvai)
• b) analizuojant cDNR seku duomenu bazese esancias
  genu sekas (vadinami eSNP). Paprastai SNP
  randamas kas 1000-2000 nukleotidu.
• Žinant SNP vieta žymincias DNR atkarpu sekas,
  tolesnis SNP taikymas ženklai palengveja
  naudojant DNR mirko sekas ar PCR ir automatinio
  sekvenavima.

Išreikšto geno dalis (cDNR dalis)
CTCAGACA
GAGTCTGT
EST žymenys (PCR pradai) identifikuojantys gena
PCR pagausimas ir sekvenavimas
Polimorfines populiacijos genotipu analize ir SNP
atradimas
Toliau SNP identifikuojami pagal tam pagamintus
žymenis (specifines DNR sekas abiejose SNP
šonuose) ir naudojami geno polimorfizmo paieškoje
SNP žymuo
75
SNP žymenu taikymas (2)
1. SNP žymenu naudojimas geno (cDNR) polimorfizmo
nustatymui polimorfineje populiacijoje.
Polimorfines populiacijos pavyzdys Pinus
sylvestris klonu archyvas
SNP žymenys
Išreikštu skirtingu fenotipu atranka
polimorfineje populiacijoje (klonu archyvas ar
tolimu populiaciju bandymas)
2. PCR produktu sekvenavimas ir SNP polimorfizmo
nustatymas
Ypac efektyvus metodas svariu genu (major genes)
identifikavai (t.y. genu kuriu polimorfizmas turi
esmine itaka fenotipinio požymio išraiškai)
butent svariu genu nustatymas naudingas
selekcijai.
Sekvenatorius
Elektroforezes gelis
Bakterijos
Fragmentai izoliuojami iš gelio ir terpiami i
bakteriju plazmides (saugojimui) ir sekvenuojami
taip nustatant SNP polimorfizma, kuris lyginamas
su fenotipu.
Alternatyviai naudojama hibridizacija su žinomu
genu cDNR DNR mirko gardelese
76
Miško medžiu klonu archyvai
Miško medžiu klonu archyvai tai sistematikiškai
išdestyti genotipu kopiju želdinai, skirti
vertingu genu išsaugojimui
Du skirtingo šakojimosi tipo klonai paprastosios
egles kloniu archyve (genus žymintis požymis
šakojimosi tipas) (Šlenava)
Poskiepis ir iskiepis genetiškai skirtingi ir
pradega augima skirtingu laiku genus žymintis
požymis pumpuru sprogimo laikas
77
3.3.8 QTL naudojimas selekcijoje
Molekuliniu žymenu, patikimai susijusiu su tam
tikrais požymiais, naudojimas atrenkant individus
vadinamas atranka žymenu pagalba (ang. marker
assisted selection (MAS)).
Pavyzdys reikia atrinkti kietos medienos
genotipus jauname amžiuje
Lauko bandymas kuris iš jaunu medeliu tures
kieta mediena?
Laboratoriniu DNR tyrimu rezultatas
elektroforezes gelis
C
B
QTL žymuo naudojamas laboratorinese analizese,
kuriu rezultate nustatomi požymiui specifiniai
DNR fragmentai
A
78
MAS nauda selekcijoje

• Pavyzdys medžiu aukštis, salygojamas 4 genu,
  kuriu reikšme išreikšta skaitine verte požymio
  vertes itakoja aplinka taip suformuodama fenotipa

Matoma vertinant žymenu sasajos su QTL ir
fenotipo matavimo duomenys
Reali padetis žinomos genu vertes, genotipas,
aplinka ir fenotipas
QTL
QTL
4
2
1
4
16
7
1
1
1
4
A
Genotipas
Fenotipas
9
1
1
2
5
Aplinka
Genotipas
Fenotipas
1
1
2
5
9
B
Aplinka
1
3
3
15
15
12
1
1
3
9
C
Poligenai
Informacija apie žymenu sasaja su QTL ženkliai
padidintu atrankos efektyvuma (padetu
identifikuoti pranašius individus).
79
MAS efektyvumas

• Tam, kad nustatyti QTL ir panaudojimo galimybes
  tam tikroje selekcineje populiacijoje, galima
  kryžminti QTL nustatymui naudota šeima su visos
  selekcines populiacijos nariu žiedadulkiu
  miškiniu ir sekti QTL žymens rekombinacijos
  desningumus palikuonyse
• QTL panaudojimas efektyviausias žemo paveldimumo
  požymiams arba požymiams kuriu nustatymui riekia
  daug laiko (reprodukciniai požymiai, medienos
  kokybe)
• Jei žinomi dvieju požymiu žymenys, efektyvu juos
  panaudoti nustatant kurie iš palikuoniu paveldejo
  abu požymius kontroliniuose kryžminimuose
• Rastam QTL suteikiamas svorinis indeksas pagal
  procenta paaiškinto tikslinio požymio kintamumo.

80
Literaturos sarašas

• Bahrman N, Damerval C (1989) Linkage
  relationships of loci controlling protein amounts
  in maritime pine (Pinus pinaster Ait.). Heredity
  63 267-274
• Binelli G, Bucci G (1994) A genetic linkage map
  of Picea abies Karts., based on RAPD markers, as
  a tool in population genetics. Theor Appl Genet
  88 283-288
• Benfey, P. 2004. Essentials of Genomics. Prentice
  Hall ISBN 0130470198.
• Cato, S.A, Gardenr, R.C., Kent, UJ., Richardson
  T.E. 2001. A rapid PCR-based method for
  genetically mapping ESTs. Theoretical and Applied
  Genetics 102 296-306.
• Carlson JE, Tulsieram LK, Glaubitz JC, Luk VWK,
  Kauffeld C, Rutledge R (1991) Segregation of
  random amplified DNA markers in F1 progeny of
  conifers. Theor Appl Genet 83 194-200
• Devey ME, Bell JC, Smith DN, Neale DB, Moran GF
  (1996) A genetic map for Pinus radiata based on
  RFLP, RAPD and microsatellite markers. Theor Appl
  Genet 92 673-679
• Devey ME, Fiddler TA, Liu BH, Knapp SJ, Neale BD
  (1994) An RFLP linkage map for loblolly pine
  based on a three-generation outbred pedigree.
  Theor Appl Genet 88 273-278
• Falconer, D.S. and Mackay, T. F.C. 1996.
  Introduction to Quantitative Genetics (4th
  Edition). Prentice Hall, ISBN 0582243025.
• FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in
  forestry, including genetic modification. Forest
  Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry
  Department, FAO. Rome, Italy.
• Grattapaglia D, Sederoff R (1994) Genetic linkage
  maps of Eucalyptus grandis and E. urophylla using
  a pseudo-testcross mapping strategy and RAPD
  markers. Genetics 137 1121-1137
• Grattapagia, D.F., Bertolucci, R., Pencher, R.,
  Sederoff, R. 1996. Genetic mapping of QTLs
  controlling growth and wood quality traits of
  Eucalyptus grandis using a materal half sib
  family and RAPD markers. Genetics 144 1205-1214.
• Harry DE, Neale DB (1994) PCR-based genetic
  markers for loblolly pine developed from cloned
  cDNAs. The International Conference on the Plant
  Genome II, 24-27 january. San Diego, CA poster
  76
• Hutchison K, Singer P, Volkaert H, Deker A,
  Costello L, Greenwood M (1994) A PCR-based
  molecular genetic map for the conifer Larix
  decidua. The International Conference on the
  Plant Genome II, 24-27 january. San Diego, CA
  poster 90

81

• Kumar, S. and Fladung, M. 2004. Molecular
  Genetics and Breeding of Forest Trees. Food
  Products Press, ISBN 1560229594.
• Krutovskii, K.V., Neale, D. B. Forest genomics
  for conserving adaptive genetic diversity. Forest
  Genetic Resource Working Paper FGR/3(E), FAO,
  Rome Italy.
• Liu, B.-H. 1998. Statistical Genomics linkage,
  mapping and QTL analysis. CRC Press, New Yourk.
• Lehner A, Campbell MA, Wheeler NC, Pöykkö T,
  Glössl J, Kreike J, Neale DB (1995)
  Identification of a RAPD marker linked to the
  pendula gene in Norway spruce (Picea abies (L.)
  Karst. f. pendula). Theor Appl Genet 91
  1092-12094
• Mei-Ling Ting Lee. 2004. Analysis of Microarray
  Gene Expression Data. ISBN 0792370872. Springer.
• Michelmore R, Paran I, Kesseli RV (1991)
  Identification of marker linked to disease
  resistance gene by bulk segregant analysis a
  rapid mathod to detect markers in specific
  genomic regions using segregating populations.
  Proc Natl Acad Sci USA 88 9828-9832
• Paran I, Michelmore RW (1993) Development of
  reliable PCR-based markers linked to downy
  resistance genes in lettuce. Theor Appl Genet 85
  985-993
• Paterson, A. H. 1997. Molecular Dissection of
  Complex Traits. CRC-Press 1 edition ISBN
  0849376866.
• Paterson, A. H. 1995. Molecular Dissection of
  Quantitave traits Progress and Prospects. Genome
  Research 3 321-333.
• Plomion C, Bahrman N, Durel C-E, O'Malley DM
  (1995a) Genomic mapping in Pinus pinaster
  (Maritime pine) using RAPD and protein markers.
  Heredity 74 661-668
• Sewell, M.M, Neatle, D. 2000. Mapping
  quasntitative trait sin forest trees. In
  Molecular biology of woody plants. Forestry
  Sciences, Vol. 64 (S.M. Jain and S.C. Minocha
  eds.) pp. 407-423.
• Sliesaravicius, A ir Stanys, V. 2005. Žemes ukio
  augalu biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius,
  ISBN 9986-433-36-3.
• Smith DN, Devey ME (1994) Occurrence and
  inheritance of microsatellites in Pinus radiata.
  Genome 37 977-983
• Wakamiya I, Newton RJ, Johnston JS, Price HJ
  (1993) Genome size and environmental factors in
  the genus Pinus. Am J Bot 80 1235-1241.
• Wilcox PL (1995) Genetic dissection of fusiform
  rust resistance in loblolly pine. Ph D thesis,
  North Carolina State University, 125p
• Verhaegen, D.C., Plomion, J-M., Gion, M. Kremer,
  A. 1997. Quantitative trait dissection analysis
  in Eucalyptus using RAPD markers. Theor. Applied
  Genetics 95 597-608.
• Yazdani R, Yeh F, Rimsha J (1995) Genomic mapping
  of Pinus sylvestris (L.) using random amplified
  polymorphic DNA markers. For Genet 2 109-116