SEPARA

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SEPARAÇÃO DE PROTEINAS POR CROMATOGRAFIA

• 1. Princípio geral da cromatografia
• a.matriz sólida capaz de reter a molécula alvo
• b.passagem (forçada ou não) do fluido contendo a
  molécula alvo através da matriz
• c.retenção da molécula alvo por certo tempo
• d.eluição separada dos componentes do fluido e,
  consequentemente da molécula alvo

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(No Transcript)
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Cromatograma e algumas variáveis características
Resolução cromatográfica
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• - Eficiência da purificação é avaliada pela
  resolução cromatográfica (RS).
• RS (trB trA) / 0,5 (WbA WbB)
• RS lt 1 gt separação incompleta
• RS 1 gt curvas se tocam na base
• RS gt 1 gt separação completa
• Normalmente a matriz é empacotada numa coluna
  (leito fixo)
• Variante adsorção em leito fluidizado. Neste
  caso há movimento da matriz

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• 2. Tipos de cromatografia (quanto à retenção e
  liberação da molécula, em leito fixo)
• 2.1 Troca iônica
• - retenção baseada na carga da superfície da
  proteina/molécula
• - mais comum, de grande aplicabilidade (resinas
  têm alta capacidade de adsorver proteínas)
• - Tem boa seletividade
• - Separa a proteina das impurezas
• - A molécula alvo é eluída com íons de mesma
  carga que esta, porém com maior força de
  interação com a fase estacionária

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• - A capacidade total de um trocador é dada pela
  quantidade de grupos carregados na fase móvel que
  podem ser trocados por unidade de volume ou massa
  de matriz.
• - Ampliação de escala aumento do volume da
  coluna (normalmente pelo aumento do seu
  diâmetro).
• Critério velocidade superficial da fase líquida
  (vazão/área da seção da coluna)
• Obs. manter constantes todas as demais variáveis

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• 2.2 Gel filtração
• - Separação por tamanho (volume efetivo) da
  molécula
• - Moléculas com volume efetivo maior que o poro
  são expulsas da coluna no volume espacial (Ve)
• - Moléculas menores penetram nos poros e em
  seguida são arrastadas pelo eluente
• - A separação obedece a sequência de volume
  efetivo
• 2.3 Cromatografia hidrofóbica
• - Retenção da molécula pela interação da sua
  região hidrofóbica com a matriz
• - A proteína é colocada num meio com alta
  concentração de sal

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• - A eluição é feita com um eluente de baixa
  concentração de sal ou aumentando-se o conteúdo
  de solvente orgânico
• - O gel é mais caro que a resina de troca iônica
  porém mais barato que as matrizes de afinidade
• 2.4 Focalização isoelétrica
• - Retenção ocorre num tipo especial de resina de
  troca iônica que contem grupos químicos que
  conferem um gradiente de pH
• - A eluição é feita com um fluido que contem um
  anfólito especialmente formulado

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• - Permite separar isoproteínas (excelente
  reso-lução)
• - Gel e eluente são caros
• aplicação nos estágios finais da purificação
  de produtos de alto valor agregado
• 2.5 Afinidade
• - A matriz é formada por um ligante
  bioespecífico e seletivo

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• O complexo formado entre o ligante e a proteína
  tem que ser reversível
• A molécula alvo é retida e as impurezas são
  eliminadas
• Finalmente a proteína é eluída e o ligante
  regenerado

2.6 Fase reversa - Compreende uma fase
estacionária apolar e uma fase móvel de
polaridade moderada. - Quanto mais apolar for a
molécula alvo maior será o seu tempo de retenção
(e vice-versa). - Alterando-se as forças de
interação entre as fases móvel e estacionária,
promove-se a eluição da molécula alvo. Isto
possibilita também regular o seu tempo de
retenção.
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figura
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• 3. Cromatografia em leito fluidizado
• Baseia-se na movimentação da matriz
• Útil para purificar proteínas de soluções
  contendo ou não material particulado (células
  suspensas ou fragmentos), uma vez que permite
  integrar as etapas de clarificação e purificação
• grande interesse

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• Ideal para os casos em que não se aplica o
  sistema de leito empacotado e para reduzir perda
  por ação de proteases (redução de tempo)
• Por exemplo, proteínas heterólogas sintetizadas
  por E. coli estão frequentemente num meio que
  apresenta elevada viscosidade e contem fragmentos
  da parede da bactéria, características que o
  tornam inadequado para uma centrifugação e
  cromatografia em leito empacotado.

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• Os ligantes clássicos
• SP sulfapropil, DEAE dietil aminoetil e IDA
  ácido iminodiacético - para adsorção por troca
  iônica,
• IgG - para adsorção por afinidade e
• Streamline Phenyl - para adsorção por
  hidrofobicidade,
• são acoplados ao suporte das partículas
  adsorventes (agarose-quartzo ou agarose-metal)
  elevando sua densidade, e viabilizando a expansão
  do leito

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• Tipos de reatores contendo o meio adsorvente
  suspenso
• Reator agitado (mais simples)
• Processo clássico é o CARE (Continuous
  Adsorption Recycle Extraction)
• Reator expandido

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Reator agitado
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• Características dos fluidos
• F1 (sup.) solução tampão contendo a molécula
  alvo, sob condições favoráveis à adsorção
• F1 (inf.) descarte - fase líquida rica em
  conta-minantes e pobre em molécula alvo

• F2 (sup.) alimentação do tampão de eluição
• F2 (inf.) solução rica em molécula alvo

• F3 (dir.) suspensão do adsorvente, rico em
  molécula alvo, que alimenta o segundo reator
• F3 (esq.) suspensão do adsorvente reciclado do
  segundo reator

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Reator expandido
Analisar F1, F2 e F3 sob ponto de vista de vazão
O material adsorvente (sólido) tem uma densidade
maior que a do líquido (eluente) que, por ser
aplicado a uma velocidade superficial adequada,
faz com que o leito sofra expansão
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Esquema ilustrativo das etapas da adsorção em
leito expandido.
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Variáveis importantes (para Leito expandido)

• A expansão do leito e os fatores a ela associados
  interferem na ligação proteína-adsorvente
• Velocidade superficial do fluido (U), velocidade
  terminal da partícula (UT), porosidade (?) e
  índice de expansão (n) do leito

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• n é função do número de Reynolds
• A velocidade superficial do fluido (U), também
  chamada de velocidade linear, é definida por
• Onde Q é a vazão de alimentação do leito
  (m3/h) e A é a área da seção transversal da
  coluna (m2).

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• A velocidade linear varia entre 100 e 300 cm/h
  nas operações de expansão, aplicação do meio e
  lavagem. Na operação de eluição a velocidade
  linear é reduzida para cerca de 100 cm/h, o que
  eleva a concentração da molécula alvo no eluído.
• Outras variáveis
• - Grau de expansão do leito (GE H/Ho)
• H altura do leito em repouso
• Ho altura do leito expandido
• valores típicos de GE 2 a 3
• - Número de pratos teóricos
• - Distribuição do tempo de residência

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Dimensionamento para Cromatografia convencional

• Variáveis envolvidas
• Número de colunas (Nco)
• Produção diária (Q)
• Capacidade da coluna por ciclo (Md)
• Número de ciclos por dia (Nci)

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Considerando algumas situações limitantes do
processo, pode-se chegar à expressão
Onde D é o diâmetro da coluna, V é a velocidade
do fluido na saída e P é a concentração de
proteína no eluído.