Hierro-Sodio-

1
Hierro-Sodio-Ácido Áscórbico

• Método Absorción Atómica Fe y Na
• Valoración oxidimétrica Vit C

2
Validación de un método analítico.

• Una vez desarrollado un método analítico, al
  igual que toda técnica analítica deberá
  validarse, es decir, se debe confirmar y
  documentar que los resultados producidos por el
  método son confiables.
• En general, para validar existen 3 tipos de
  validación
• -Validación Prospectiva es aquella validación
  realizada a métodos analíticos nuevos.
• -Validación Retrospectiva Para métodos
  analíticos antiguos, pero que se usan en forma
  rutinaria, y que no han sido validados.
• -Revalidación repetición parcial o total de una
  validación debido a cambios efectuados, que
  puedan afectar a la capacidad del método
  validado. (1)
• La validación se puede realizar mediante estudios
  intralaboratorio o interlaboratorios.
• -Estudios Intralaboratorio este tipo de
  validación lo realiza un laboratorio
  individualmente, utilizando materiales de
  referencia, comparación con otro método,
  utilizando muestras blanco o muestras positivas
  fortificadas, etc.
• -Estudios interlaboratorios conjunto de
  mediciones a un nivel o varios niveles de
  concentración del analito problema, ejecutadas
  independientemente, por varios laboratorios,
  sobre muestras de un material dado. (11)

3
Validación

• Al momento de validar un método analítico se
  requiere actuar mediante procedimientos correctos
  entre los que se incluyen una buena organización
  funcional personal adecuadamente adiestrado en
  la aplicación del método instalaciones adecuadas
  y suficientes equipos, reactivos y material de
  laboratorio apropiado y en perfectas condiciones
  para su uso métodos escritos, actualizados y
  aprobados. De esta forma se puede garantizar la
  calidad de los resultados obtenidos en el
  laboratorio.

4
Parámetros Fundamentales de Validación.

• Una vez que se ha realizado el ajuste de los
  parámetros y se ha probado con éxito el método en
  muestras, se está en condiciones de realizar la
  validación del método, para poder confirmar y
  documentar que los resultados obtenidos por el
  método son seguros y confiables
• En el proceso de validación, los parámetros que
  generalmente son evaluados son
• -Selectividad
• -Linealidad
• -Precisión
• -Exactitud
• -Sensibilidad

5
Validación

• Selectividad (?)
• La selectividad de un sistema depende de la
  interacción de todos los componentes, Longitud de
  onda, interferentes, etc y muestra.

6
Selectividad o especificidad.

• La selectividad o especificidad de un método
  analítico se refiere a la capacidad de un método
  de producir una señal medible debida sólo a la
  presencia del analito, libre de interferencias de
  otros componentes en la matriz de muestra, estas
  interferencias pueden ser productos de
  degradación, metabolitos del mismo analito en un
  fluido biológico, etc.
• La selectividad se puede controlar simplemente
  por la adición, por ejemplo del doble de estándar
  puro, verificando el aumento de su señal.

7
Linealidad.

• La linealidad de un método analítico se refiere
  a la capacidad de un método de obtener resultados
  linealmente proporcionales entre la concentración
  de analito y su respuesta. Este parámetro se
  considera como un criterio inicial de validación,
  y es necesario verificarlo si se va a trabajar
  con un sólo estándar en las determinaciones de
  rutina. Al trabajar con estándares múltiples se
  puede aceptar métodos no lineales,.
• Junto con establecer la linealidad del método se
  puede estimar el rango de linealidad del método,
  es decir, el intervalo de concentraciones para el
  cual el método ha demostrado responder en forma
  lineal y dentro del cual se puede estimar la
  cantidad de analito por interpolación.
• Para determinar la linealidad se prepara una
  serie de, al menos, cinco diluciones de un
  estándar, las cuales deben estar de acuerdo con
  las cantidades esperadas de analito en la
  muestra. Se efectúa el análisis siguiendo
  exactamente el procedimiento descrito.
• En procedimientos cromatográficos se recomienda
  efectuar las inyecciones por triplicado, a no ser
  que se use un patrón interno.. Para Absorción
  atómica a lo menos el promedio de 3 lecturas por
  concentración.

8
El coeficiente de correlación(r)

• a) Coeficiente de correlación (r).
• El coeficiente de correlación refleja el grado
  de relación o ligazón entre las variables x
  (concentración), y (respuesta). El valor r 1
  indica una recta perfectamente lineal de
  pendiente positiva, r -1 una recta
  perfectamente lineal de pendiente negativa y r 0
  la no correlación entre x e y. En análisis
  químico se obtienen valores de r elevadas,
  iguales o superiores a 0,999, si bien en análisis
  de trazas se aceptan valores mas bajos (iguales o
  superiores a 0,99).
• Sin embargo, el mejor indicador del modelo lineal
  no es r sino un test estadístico, en el cual se
  calcula un valor tr (n-2 grados de libertad y se
  compara con el valor de t tabulado para el nivel
  de confianza requerido. En este caso si tr es
  mayor que el t de tabla, significa que existe una
  correlación lineal entre x e y, para el nivel de
  confianza requerido.
• tr ?r? ?(n-2)__
• ?(1-r2)
• Donde
• r coeficiente de correlación
• n numero de mediciones

9
Curva de calibración que relaciona respuesta

• área, alturas, absorbancia, etc., con
  concentración o cantidad de analito. La cual
  posteriormente se gráfica para su documentación e
  interpretación estadística.
• La recta de calibración es del tipo
• y bx a
• Donde
• x corresponde a la concentración
• y corresponde a la respuesta
• b el valor de la pendiente o variación de
  respuesta por unidad de concentración.
• a el termino independiente o intercepto sobre
  el eje Y.
• Interpretación estadística de la regresión
  lineal.
• La representación gráfica suele ser suficiente.
  Sin embargo conviene efectuar una interpretación
  estadística de la regresión lineal.

10
b) Significación estadística de la varianza de la
pendiente b

• La pendiente b se llama también coeficiente de
  regresión, y se determina como parámetro
  indicativo de la sensibilidad, el cual a mayor
  pendiente, mayor sensibilidad (respuesta del
  método frente a los cambios de concentración del
  analito). La varianza de la pendiente Sb2 se
  utiliza como expresión matemática de la
  linealidad, a menor varianza mejor linealidad,
  para expresar la linealidad también se utiliza la
  desviación estándar de la pendiente Sb y el
  coeficiente de variación (CV)
• A su vez los limites de confianza de la pendiente
  se hallan a partir de la expresión
• b t Sb
  
• Donde
• b valor de la pendiente
• t valor de la distribución de Student para n-2
  grados de libertad para el grado de confianza
  escogido.
• Sb desviación estándar de la pendiente.

11
c) Significación estadística de la varianza de la
ordenada al origen

• El valor de a ( ordenada al origen), se
  determina para verificar si la recta pasa por el
  origen y que cualquier desviación puede
  adjudicarse únicamente a valores aleatorios, por
  lo que en un caso ideal debe ser cero. Al igual
  que en el caso de la pendiente para poder obtener
  los intervalos de confianza de la ordenada al
  origen se calcula en función de su varianza Sa2,
  su desviación estándar Sa. Y estos se hallan a
  través de la formula
• a t Sa
  
• Donde
• a valor de la ordenada al origen.
• t valor de la distribución de student para n-2
  grados de libertad para el grado de confianza
  escogido.
• Sa desviación estándar de a

12
Precisión

• La precisión es el grado de concordancia entre
  los valores de una serie repetida de ensayos
  analíticos efectuados sobre una muestra homogénea
  o, expresado de otra forma, la dispersión de los
  valores analíticos alrededor de su media. La
  precisión indica la capacidad del método para dar
  resultados semejantes cuando se aplica
  repetidamente a una muestra.
• La precisión se expresa matemáticamente por la
  media para el valor central y la desviación
  estándar para la dispersión de los resultados, y
  más comúnmente por la desviación estándar
  relativa (RSD).
• La precisión requiere del análisis sobre una
  muestra y la precisión así obtenida se denomina
  del método, puesto que incluye todo el
  procedimiento analítico, desde la preparación de
  la muestra hasta la lectura instrumental. También
  se puede determinar directamente la precisión del
  sistema, hallando la variabilidad de respuesta de
  una solución patrón. Por lo que la precisión se
  distinguirá en 2 tipos de estudios

13
Precisión

• -Precisión del sistema la cual evalúa la
  dispersión de al menos 6 inyecciones del estándar
  o repeticiones de lecturas de absorbancias.
• -Precisión del método evaluando la dispersión de
  varias preparaciones de la muestra final
  homogénea
• A su vez la precisión deberá medirse en
  condiciones repetitivas, es decir, mismas
  condiciones, sobre la misma muestra, por un mismo
  analista, en el mismo laboratorio, el mismo día y
  con los mismos aparatos y reactivos.
• También debe medirse en condiciones
  reproducibles, es decir, medir la precisión de un
  método, efectuado sobre la misma muestra pero en
  condiciones diferentes, analistas, aparatos,
  días, etc.
• El cociente repetibilidad/reproducibilidad, es
  de gran utilidad para evaluar la precisión de un
  método analítico. Su valor según estudios
  realizados por la AOAC es normalmente comprendido
  entre 1,5 y 2. Valores mayores a 2 son
  indicadores de un método muy personal y valores
  inferiores a 1,5 indican pobre repetibilidad.

14
Precisión

• Los criterios de aceptación pueden ser variables,
  por ejemplo la USP indica una RSD del sistema de
  no más de 2, inyectando 5 veces una solución
  estándar. Existen tablas que relacionan la RSD
  máxima aceptable para un método analítico en
  función de los límites de aceptación y del número
  de réplicas.
• En muchos casos debe indicarse el intervalo de
  confianza de la medida, es decir el rango en el
  cual se encuentra presente el analito,
  preferentemente, cuando el numero de muestras es
  pequeño (menor de 30), las medidas
  independientes, y la distribución normal, puede
  calcularse de acuerdo a la distribución de
  Student según la formula
• X - t?,? x S lt ? lt X t?,? x S
  
• ?n ?n
• Donde
• X promedio de las mediciones
• t?,? es el valor de Student, tabulado para n
  mediciones con ? n-1 grados de libertad y para
  el nivel ? de confianza empleado, generalmente
  95.
• S desviación estándar de las mediciones
• n numero de mediciones.

15
Sensibilidad

• La sensibilidad de un método analítico se
  relaciona con la cantidad mínima de analito
  requerida para dar un resultado significativo,
  cualitativo o cuantitativo. Debe distinguirse
  entre sensibilidad de calibrado y sensibilidad
  analítica.
• a) Sensibilidad de calibrado corresponde a la
  pendiente de la recta de calibración, es decir,
  la señal o respuesta por unidad de concentración.
• b) Sensibilidad analítica corresponde a la
  sensibilidad de calibrado dividida por la
  desviación estándar de la respuesta.
• Los parámetros a definir para poder evaluar la
  sensibilidad de un método analítico son los
  limites de detección y de cuantificación.

16
Los pasos a seguir son los siguientes

• a) Se determina la pendiente de la curva de
  calibración (concentración v/s respuesta) en el
  rango apropiado
• b) Se realiza otra curva de calibración,
  inyectando cada punto por triplicado, pero en
  este caso para concentraciones menores de
  analito, determinándose la ecuación de esta nueva
  recta de calibración y se extrapola la respuesta
  a concentración cero, obteniéndose un estimado de
  la respuesta del blanco Ybl
• c) Se determina la desviación estándar
  correspondiente a cada concentración del punto 2,
  se calcula la recta correspondiente a
  concentración v/s s y se extrapola como en el
  caso anterior la desviación estándar a
  concentración cero, obteniéndose el estimado
  correspondiente a la desviación estándar del
  blanco Sbl

17
a) Limite de detección

• corresponde según la USP XXII, a la menor
  concentración de analito en una muestra que puede
  ser detectada, pero no necesariamente
  cuantificada, bajo las condiciones experimentales
  establecidas y se expresa en unidades de
  concentración (, ppm, ppb, etc.). Se calcula
  como
• Limite de detección Ybl 3 Sbl_
  
• b
• Donde
• Ybl valor estimado de la respuesta del blanco.
• Sbl desviación estándar estimada del blanco
• b pendiente de la curva de calibración.

18
b) Limite de cuantificación

• según USP XXII, la menor concentración de analito
  de una muestra que puede ser cuantificada con
  precisión y exactitud aceptable bajo las
  condiciones experimentales establecidas y se
  expresa también en unidades de concentración. Se
  calcula según
• Limite de cuantificación Ybl 10 Sbl_
  
• 
  b
• Donde
• Ybl valor estimado de la respuesta del blanco.
• Sbl desviación estándar estimada del blanco
• b pendiente de la curva de calibración.
• Los límites de detección y cuantificación se
  estiman a partir de la curva de regresión o
  calibración, siempre que se hayan considerado
  concentraciones bajas de analito, por
  extrapolación a concentración cero.

19
Exactitud.

• La exactitud de un método, también conocida como
  error sistemático o tendencia, corresponde a la
  capacidad del método analítico para dar
  resultados lo más próximos posibles al valor
  verdadero. La exactitud o bien podríamos llamarla
  inexactitud, debe ser tan pequeña como sea
  posible, para que el valor promedio se aproxime
  al de referencia, es decir, la recuperación del
  analito debe acercarse al 100.
• No deben confundirse exactitud y precisión. La
  precisión está relacionada con la dispersión de
  una serie de mediciones, pero no da ninguna
  indicación de lo cerca que están del valor
  verdadero. Se pueden tener mediciones muy
  precisas pero poco exactas.

20
Exactitud.

• Matemáticamente la exactitud se expresa en forma
  de porcentaje de recuperación de la cantidad de
  analito presente en la muestra, o bien en forma
  de diferencia entre el valor hallado y el valor
  verdadero. Si bien el valor verdadero de
  concentración no se conoce sino que solo puede
  estimarse, es posible preparar una muestra por un
  procedimiento más exacto, y utilizarla como
  referencia.
• Recuperación R ?X_ x 100
• X
• Donde
• ?
• X valor verdadero
• X promedio de las mediciones

21
Exactitud

• En el análisis de trazas (micro componentes), no
  siempre se alcanzan recuperaciones tan elevadas y
  se consideran valores habituales de recuperación
  entre el 60 y 80. Para determinar si el valor
  medio hallado y el valor considerado verdadero no
  difieren significativamente, para esto se efectúa
  un test estadístico, como lo es el test de
  Student, para un nivel de confianza determinado.
  El test de Student emplea, al menos, 3
  concentraciones del analito, preparadas por
  triplicado, comprendidas dentro del rango de
  linealidad del sistema, en general se utilizan
  concentraciones correspondientes al 80, 100 y
  120 del valor esperado.

22
Exactitud.

• En este caso, el valor de t se calcula como
• texp (100-R)_
  
• RSD x ?n
• Donde
• R recuperación porcentual.
• RSD desviación estándar relativa de las
  mediciones
• n número de repeticiones
• Los valores de texp se comparan con los
  tabulados para el intervalo de confianza
  requerido con n-1 grados de libertad, y la
  exactitud se evalúa para el promedio de
  recuperación de todas las concentraciones. Si
  texp lt ttabla, no existe diferencia significativa
  con el 100 de recuperación y la exactitud es
  apropiada. (1)

23
Test de ANOVA- homogeneidad
24
Exactitud
25

• Sodio
• Método Espectrofotometría de
  Absorción atómica

26
Papel biológico

• El catión sodio (Na) tiene un papel fundamental
  en el metabolismo celular, por ejemplo, en la
  transmisión del impulso nervioso (mediante el
  mecanismo de bomba de sodio-potasio). Mantiene el
  volumen y la osmolaridad. Participa, además del
  impulso nervioso, en la contracción muscular, el
  equilibrio ácido-base y la absorción de
  nutrientes por las células.
• La concentración plasmática de sodio es en
  condiciones normales de 135 - 145 mmol/l. El
  aumento de sodio en la sangre se conoce como
  hipernatremia y su disminución hiponatremia

27
Compuestos

• Los compuestos de sodio de mayor importancia
  industrial son
• Sal común (NaCl).
• Carbonato de sodio (Na2CO3).
• Bicarbonato de sodio (NaHCO3).
• Sosa cáustica (NaOH). El hidróxido de sodio, más
  conocido como soda cáustica, es una base muy
  fuerte y corrosiva usada en productos destinados
  a la limpieza de desagües y al desengrase de
  hornos. Cuando se disuelve en agua produce una
  reacción muy exotérmica (-42,9 kJ/mol). Su poder
  corrosivo hace de la soda cáustica un compuesto
  letal para los tejidos vivos y los compuestos
  orgánicos, e incluso puede atacar al vidrio en
  caso de que el contacto sea permanente. En
  presencia del dióxido de carbono atmosférico
  produce carbonato de sodio, por lo que sus
  soluciones son poco estables.
• Nitrato de sodio (NaNO3).
• Tiosulfato de sodio (Na2S2O3 5H2O).
• Bórax (Na2B4O7 10H2O).
• Yoduro de sodio (NaI)

28
Sodio en la dieta

• La mayor fuente de sodio es el cloruro de sodio o
  una ración común de sal, del cual el sodio
  constituye el 40. Sin embargo, todos los
  alimentos contienen sodio en forma natural,
  siendo más predominante la concentración en
  alimentos de origen animal que vegetal.
  Aproximadamente 3 gr. de sodio están contenidos
  en los alimentos que se consumen diariamente, sin
  la adición de cloruro de sodio o sal común, esto
  es importante considerarlo en pacientes que
  tengan una restricción o disminución en la
  ingesta de sal diaria (pacientes nefrópatas,
  diabéticos, hipertensos). El requerimiento de
  sodio es de 500 mg /día aproximadamente (3). La
  mayoría de las personas consumen más sodio que el
  que fisiológicamente necesitan, para ciertas
  personas con presión arterial sensible al sodio,
  esta cantidad extra puede causar efectos
  negativos sobre la salud.

29
REFERENCIAS

• AOAC Official Method 985.35. AOAC Official
  Methods of Analysis (2005). Cp. 50, p.15.
• M Series Atomic Absorption, Manual de
  operación,1999-2006 Thermo Electron Manufacturing
  Ltda.
• Spectrometers Manual de Métodos, 9499 230 24011,
  Issue 4 280804. Thermo Electron
  Corporation

30
Optimización del equipo

• 1.- Realizar la puesta a punto y optimización de
  las condiciones del espectrofotómetro (ajuste de
  quemador y lámpara) para el metal a determinar
  siguiendo las indicaciones del manual o
  instructivo del equipo de medición.
• 2. Aspirar por el capilar del quemador blanco y
  haga autocero. Ajustar la sensibilidad con
  concentración de estándar referencial indicado en
  el manual para lograr la máxima sensibilidad.
• 3. Aspirar las soluciones estándares de la curva
  de calibración en orden decreciente por el
  capilar del quemador y leer en E.A.A. Para
  realizar la calibración se deben usar a lo menos
  3 estándar y un blanco. El coeficiente de
  correlación de la curva de regresión lineal debe
  ser gt 0,99.
• 4. Aceptar curva de calibración, aspirar un
  material de referencia control o una solución
  control del analito a analizar, verificar que se
  encuentra dentro del rango de aceptabilidad.
• 5. Proceder a realizar las lecturas de las
  muestras en el EAA.
• 6. Las lecturas son obtenidas por interpolación
  desde la curva de calibración y están expresados
  en mg/L del analito correspondiente.
• 7. En caso, de que el valor este fuera de rango
  del máximo de la curva de calibración, realice
  una dilución y registre el valor del factor de
  dilución (F.D.) aplicado.
• 8. Registre los valores obtenidos.

31
Reactivos

• 6.3.1. Solución estándar stock comercial de
  multielementos de metales, 100 mg/L, certificada.
• 6.3.2. Solución estándar stock comercial de
  Sodio 1000 mg/L, certificada.
• 6.3.3. Gases calidad AAS Acetileno 99.99
  , Oxido nitroso 99.99.
• 6.3.4. Agua grado reactivo, destilada o
  desionizada, tipo I.
• 6.3.5. Acido nítrico (HNO3) 65 14 N, calidad
  AAS.(suprapur)
• 6.3.6. Acido clorhídrico (HCl) 37, p.a.
• 6.3.7. Oxido de lantano (La2O3), 99.99, calidad
  AAS.
• 6.3.8. Solución de cloruro de lantano ( LaCl3, 1
  p/v) Pesar 11,7 g (/- 100mg) de La2O3 y llevar
  a un matraz aforado de 1L, agregar un poco de
  agua grado reactivo para disolver el polvo,
  agregar bajo campana lentamente 50 mL de HCl 37
  ( Precaución Reacción exotérmica!). Agitar
  suavemente, hasta disolver todo el reactivo y
  luego aforar con agua grado reactivo. Estable 6
  meses a temperatura ambiente.
• 6.3.9. Solución de ácido nítrico 20 v/v para
  eliminación de trazas en lavado de material En
  un contenedor de plástico para lavar material,
  agregar 5 l de agua grado reactivo, luego, medir
  1L de HNO3 65 con una probeta, verter agitando
  lentamente al contenedor con el agua grado
  reactivo y mezclar suavemente.
• 6.3.10. Solución de ácido nítrico 1M en un
  matraz de 1 L agregar unos 200 mL de agua grado
  reactivo, luego medir 71,5 mL de HNO3 65 14N y
  agregar bajo campana lentamente al matraz
  (Precaución Reacción exotérmica!), aforar con
  agua grado reactivo y agitar. Almacenar en frasco
  vidrio o plástico ámbar. Duración 6 meses a
  temperatura ambiente.

32
Selectividad Sodio

• Para determinar la selectividad se utilizó un
  material de referencia matriz liquida
  multielementos trazables al NIST, con adición de
  oxido de lantano acorde a la metodología
  analítica, con lo cual se pudo observar que el
  método presenta una buena selectividad.

33
(No Transcript)
34
Determinación de Sodio Digestión de la muestra

• Moler y homogeneizar la muestra ..
• Pesar exactamente en un crisol 3 g de muestra
  dependiendo de la concentración esperada del o
  los analitos. Registre el peso.
• Colocar el crisol con la muestra sin tapar en
  placa calefactora, estufa o mufla a 100º C por 30
  minutos.
• Colocar el crisol con la muestra tapado en mufla
  a 525ºC por un periodo de 3 a 5 hrs (lt 8 hrs),
  hasta obtener cenizas blancas. De obtenerse
  cenizas grises dejar enfriar y agregar al crisol
  de 0,5 a 3 mL aproximadamente de HNO3 65,
  colocar el crisol destapado en placa calefactora
  a unos 100ºC, hasta evaporar. (realizar
  procedimiento bajo campana extractora de
  gases).Luego llevar nuevamente mufla a 525ºC por
  1 a 2 hrs hasta cenizas blancas.
• Digerir las cenizas blancas contenidas en el
  crisol con 5 mL de HNO3 1M en placa calefactora
  cuantitativamente llevar el licor de cenizas a un
  matraz aforado de 50 mL, a través de 2 lavados
  con porciones de alrededor de 3 mL de HNO3 1M,
  agregar al matraz 5 mL de LaCl3, 1 p/v y aforar
  con HNO31M. La solución esta lista para ser leída.

35
Sodio 1
36
Sodio 2
37

• Hierro
• Método Espectrofotometría de
  Absorción atómica con Llama

38
Metabolismo del hierro

• Aunque solo existe en pequeñas cantidades en los
  seres vivos, el hierro ha asumido en papel vital
  en el crecimiento y en la supervivencia de los
  mismos y es necesario no solo para lograr una
  adecuada oxigenacion tisular sino también para el
  metabolismo de la mayor parte de las células. El
  hierro es el elemento numero 26 en la tabla
  periódica y tiene un peso atómico de 55,85. Es el
  cuarto elemento en abundancia y el segundo metal
  más abundante en la corteza terrestre. El hierro
  fue seleccionado en la evolución de los tiempos
  de entre muchos metales transicionales para
  formar la ENERGIA VITAL en la fisiología de los
  vertebrados.
• En la actualidad con un incremento en el oxigeno
  atmosférico el hierro se encuentra en el medio
  ambiente casi exclusivamente en forma oxidada (ó
  ferrica ó Fe) y en esta forma es poco
  utilizable.
• En los adultos sanos el hierro corporal total es
  de 3 a 4 gramos ó 35 mg/kg en las mujeres a 50
  mg/kg en los hombre se encuentra distribuido en
  dos formas
• 70 como hierro funcional (2.8g)
• Eritrocitos (65).
• Tisular mioglobinas (4).
• Enzimas dependientes del hierro (hem y no hem)
  1
• Estas son enzimas esenciales para la función de
  las mitocondrias y que controlan la oxidación
  intracelular (citocromos, oxidasas del
  citrocromo, catalasas, peroxidasas).
• Transferrina (0.1), la cual se encuentra
  normalmente saturada en 1/3 con hierro.
• La mayor atención con relación a este tipo de
  hierro se ha enfocado hacia el eritrón, ya que su
  estatus de hierro puede ser fácilmente medible y
  constituye la principal fracción del hierro
  corporal.

39

• 30 como hierro de depósito (1g)
• Ferritina (2/3).
• Hemosiderina (1/3).
• Hemoglobina transporta el oxigeno a las celulas.
  
• Transferrina transporta el hierro a través del
  plasma.
• Ferritina principal forma de deposito del hierro
  en los tejidos.
• Estudios recientes de disponibilidad del hierro
  de los alimentos han demostrado que el hierro del
  hem es absorbido bien, pero el hierro no hem se
  absorbe en general muy pobremente y este ultimo
  es el hierro que predomina en la dieta de gran
  cantidad de gente en el mundo.cita requerida
• Hem como hemoglobina y mioglobina, presente
  principalmente en la carne y derivados. No hem.
• La absorción del hierro hem no es afectada por
  ningun factor ni dietetico, ni de secreción
  gastrointestinal. Se absorbe tal cual dentro del
  anillo porfirinico. El hierro es liberado dentro
  de las celulas de la mucosa por la HEM oxigenasa,
  enzima que abunda en las celulas intestinales del
  duodeno.
• Las absorción del hierro no hem, por el contrario
  se encuentra afectada por una gran contidad de
  factores dieteticos y de secreción
  gastrointestinal que se analizanran
  posteriormente.
• El hierro procedente de la dieta, especialmente
  el no hem, es hierro férrico y debe ser
  convertido en hierro ferroso a nivel gástrico
  antes que ocurra su absorción en esta forma
  (hierro ferroso) a nivel duodenal principalmente.
• Otros factores, independientes de la dieta que
  pueden influir en la absorción del hierro son

40
Funciones Hierro

• El hierro se encuentra en prácticamente todos los
  seres vivos y cumple numerosas y variadas
  funciones.
• Hay distintas proteínas que contienen el grupo
  hemo, que consiste en el ligando porfirina con un
  átomo de hierro. Algunos ejemplos
• La hemoglobina y la mioglobina la primera
  transporta oxígeno, O2, y la segunda lo almacena.
  
• Los citocromos los citocromos c catalizan la
  reducción de oxígeno a agua. Los citocromos P450
  catalizan la oxidación de compuestos
  hidrofóbicos, como fármacos o drogas, para que
  puedan ser excretados, y participan en la
  síntesis de distintas moléculas.
• Las peroxidasas y catalasas catalizan la
  oxidación de peróxidos, H2O2, que son tóxicos.
• Ejemplo de centro de una proteína de Fe/S
  (ferredoxina)
• Las proteínas de hierro/azufre (Fe/S) participan
  en procesos de transferencia de electrones.
• También se puede encontrar proteínas en donde
  átomos de hierro se enlazan entre sí a través de
  enlaces puente de oxígeno. Se denominan proteínas
  Fe-O-Fe. Algunos ejemplos
• Las bacterias metanotróficas, que emplean el
  metano, CH4, como fuente de energía y de carbono,
  usan proteínas de este tipo, llamadas
  monooxigenasas, para catalizar la oxidación de
  este metano.
• La hemeritrina transporta oxígeno en algunos
  organismos marinos.
• Algunas ribonucleótido reductasas contienen
  hierro. Catalizan la formación de
  desoxinucleótidos.
• Los animales para transportar el hierro dentro
  del cuerpo emplean unas proteínas llamadas
  transferrinas. Para almacenarlo emplean la
  ferritina y la hemosiderina. El hierro entra en
  el organismo al ser absorbido en el intestino
  delgado y es transportado o almacenado por esas
  proteínas. La mayor parte del hierro se reutiliza
  y muy poco se excreta.
• Tanto el exceso como el defecto de hierro pueden
  provocar problemas en el organismo. El
  envenamiento por hierro ocurre debido a la
  ingesta exagerada de esté (como suplemento en el
  tratamiento de anemias).
• La hemocromatosis corresponde a una enfermedad de
  origen genético, en la cual ocurre una excesiva
  absorción del hierro, el cual se deposita en el
  hígado, causando disfunción de este y
  eventualmente llegando a la cirrosis hepática. En
  las transfusiones de sangre se emplean ligandos
  que forman con el hierro complejos de una alta
  estabilidad para evitar que quede demasiado
  hierro libre.
• Estos ligandos se conocen como sideróforos.
  Muchos microorganismos emplean estos sideróforos
  para captar el hierro que necesitan. También se
  pueden emplear como antibióticos, pues no dejan
  hierro libre disponible.

41
REFERENCIAS

• Official methods of analysis AOAC 15 th edition,
  vol 2, pág 1106,1107, año 1990
• M Series Atomic Absorption, Manual de
  operación,1999-2006 Thermo Electron Manufacturing
  Ltda.
• Spectrometers Manual de Métodos, 9499 230 24011,
  Issue 4 280804. Thermo Electron Corporation

42
Selectividad

• Dada que las líneas de emisión de la lámpara del
  cátodo hueco de Fe son muy estrechas es rara la
  interferencia. Si interfiere en la dispersión de
  la luz la combustión incompleta de la matriz
  orgánica o Interferente espectral hierro 213,859
  nm y el Zinc 213,856 lo cual produce una
  sobreposición de 0,003 nm
• Para determinar la selectividad se utilizó una
  matriz de harina sin fortificar (grado de
  extracción, 78), y una matriz de harina con
  adición de estándar de hierro y sulfato y
  pirofosfato de hierro con lo cual se pudo
  observar que el método presenta una buena
  selectividad, ya que las matrices no se ven
  afectadas por la presencia de otros analitos
  interferentes

43
Reactivos, insumos

• Matraces aforados de 50 mL
• Piseta
• Espátula, toalla absorbente, plumón permanente
• Cápsulas de porcelana para digestión de 25cm de
  diámetro
• Elementos de seguridad como guantes y anteojos
• Balanza analítica sensibilidad 0.1 mg
• Campana de extracción de gases
• Espectrofotómetro de absorción atómica con llama
• Homogeneizador de muestras
• Plancha calefactora
• Agua para análisis, desionizada
• Ácido clorhídrico 37 p.a.
• Ácido nítrico 65 p.a
• Estándar de Hierro o multielementos
• Lámpara de hierro
• Micropipeta de 100ul a 1000 ul

44
Curva de calibración de estándares

• 1.- Estándares de hierro solución concentrada de
  1000 mg/L. o St multielemenos 100 ppm
• 2.- Estándar de 5 mg/L tomar 0,5 mL del estándar
  concentrado de 1000 mg/L 5 mL de HCL
  concentrado y aforar a 100 mL con agua
  desionizada.
• 3.- Estándar de 2 mg/L tomar 0,2 mL del estándar
  concentrado de 1000 mg/L 5 mL de HCL
  concentrado y aforar a 100 mL con agua
  desionizada.
• 4.- Estándar de 1 mg/L tomar 0,1
  mL del estándar concentrado de 1000 mg/L
  5 mL de HCL concentrado y aforar a 100 mL con
  agua desionizada

45
Condiciones del equipo de FLAA

• Longitud de Onda 248,3 nm
• Franja de paso (slite) 0,2 nm
• Tipo de Llama Aire-acetileno
• Flujo de Combustible 0,8 a1,0 L/min
• Corriente de la lámpara 75
• Tipo de señal Continua
• T de ignición 800C
• T de atomización 2300 C
• Corrector de background on

46
Determinación de Hierro Digestión de la muestra

• Moler y homogeneizar la muestra ..
• Pesar exactamente en un crisol 3 g de muestra
  dependiendo de la concentración esperada del o
  los analitos. Registre el peso.
• Colocar el crisol con la muestra sin tapar en
  placa calefactora, estufa o mufla a 100ºC por 30
  minutos.
• Colocar el crisol con la muestra tapado en mufla
  a 550ºC por un periodo de 5 a 6 hrs (lt 8 hrs),
  hasta obtener cenizas blancas. De obtenerse
  cenizas grises dejar enfriar y agregar al crisol
  de 0,5 a 3 mL aproximadamente de HCL 11 colocar
  el crisol destapado en placa calefactora a unos
  100ºC, hasta evaporar. (realizar procedimiento
  bajo campana extractora de gases).Luego llevar
  nuevamente mufla a 550ºC por 1 a 2 hrs hasta
  cenizas blancas.
• Digerir las cenizas blancas contenidas en el
  crisol con 5 mL de HCL 11 en placa calefactora
  cuantitativamente llevar el licor de cenizas a un
  matraz aforado de 50 mL, a través de 2 lavados
  con porciones de alrededor de 3 mL de HCL 11,
  aforar con agua. La solución esta lista para ser
  leída.

47
Test de ANOVA- homogeneidad
48
Interpretación, cálculos, expresión e informede
los resultados

• Para calcular la concentración de sodio o hierro
  en la muestra en mg/kg, aplique la siguiente
  formula
• mg/Kg del analito L x 50 x F.D.
• P
• L Lectura de la concentración en mg/L obtenida
  por la interpolación de la curva de calibración.
• FD Factor de dilución. En caso de no realizar
  ninguna dilución, es igual a 1.
• P Peso de la muestra en gramos
• Los resultados obtenidos se expresan en muestras
  sólidas mg/Kg o en muestras líquidas mg/L
• ENO sodio en mg/100g y mg/porción de consumo
  habitual

49

• ÁCIDO ASCÓRBICO
• Método J.Tillman

50
La Vitamina C o enantiómero L del ácido ascórbico,

• es un nutriente esencial para los primates
  superiores y un pequeño número de otras especies.
  La presencia de esta vitamina es requerida para
  un cierto número de reacciones metabólicas en
  todos los animales y plantas y es creada
  internamente por casi todos los organismos,
  siendo los humanos una notable excepción. Es
  ampliamente sabido que su deficiencia causa
  escorbuto en humanos,1 2 3 de ahí el nombre de
  ascórbico que se le da al ácido. Es también
  ampliamente usado como aditivo alimentario.
• El farmacóforo de la vitamina C es el ion
  ascorbato. En organismos vivos, el ascorbato es
  un antioxidante, pues protege el cuerpo contra la
  oxidación, y es un cofactor en varias reaciones
  enzimáticas vitales.

51
Efectos La vitamina C

• ayuda al desarrollo de dientes y encías, huesos,
  cartílagos, a la absorción del hierro, al
  crecimiento y reparación del tejido conectivo
  normal (piel más suave, por la union de las
  células que necesitan esta vitamina para unirse),
  a la producción de colágeno (actuando como
  cofactor en la hidroxilación de los aminoácidos
  lisina y prolina), metabolización de grasas, la
  cicatrización de heridas. Su carencia ocasiona el
  escorbuto, también resulta esta vitamina un
  factor potenciador para el sistema inmune aunque
  algunos estudios ponen en duda esta última
  actividad de la vitamina C.

52
Indicaciones

• La Vitamina C es esencial para el desarrollo y
  mantenimiento del organismo, por lo que su
  consumo es obligatorio para mantener una buena
  salud.
• La vitamina C sirve para
• Evitar el envejecimiento prematuro (proteger el
  tejido conectivo, la "piel" de los vasos
  sanguíneos).
• Facilita la absorción de otras vitaminas y
  minerales.
• Antioxidante.
• Evita las enfermedades degenerativas tales como
  arteriosclerosis, cáncer, enfermedad de
  Alzheimer.
• Evita las enfermedades cardíacas (tema tratado
  más adelante).
• Desde los descubrimientos de Linus Pauling se
  aseveraba que la vitamina C reforzaba el sistema
  inmune y prevenía la gripe, pero investigaciones
  realizadas en los 1990s parecen refutar esta
  teoría y, en todo caso, han demostrado que el
  consumo en exceso (a diferencia de lo preconizado
  por Pauling y sus seguidores) de suplementos de
  vitamina C son poco recomendables, porque,entre
  otras cosas, un consumo excesivo puede provocar
  alteraciones gastrointestinales.
• Requerimientos diarios
• El ser humano parece ser extremadamente eficiente
  en la reutilización de la vitamina C, por lo que
  sus requerimientos son 50 veces menores que en el
  resto de los simios. Al ser una vitamina
  hidrosoluble su eliminación por el riñón por
  diuresis es extremadamente eficaz, por lo que los
  excesos se pueden eliminar en menos de cuatro
  horas. Todo ello hace que haya muy poco consenso
  en cual es la cantidad mínima y la cantidad
  máxima. Prueba de ellos damos las siguientes
  referencias
• 40 miligramos por día Food Standards Agency1 del
  Reino Unido
• 45 miligramos por día La Organización Mundial de
  la Salud4
• 6095 miligramos por día National Academy of
  Sciences5 de los Estados Unidos. Segun este
  organismo no se deben exceder los 2000 miligramos
  por día.
• 400 miligramos por día the Linus Pauling
  Institute.6
• 1.000 miligramos por día Profesor Roc Ordman,
  para la investigación de los radicales libres.7
• 3.000 miligramos por día (hasta 300.000 mg para
  enfermos) La Fundación para la vitamina C.8
• 6.00012.000 miligramos por día Thomas E. Levy,
  Colorado Integrative Medical Centre.9
• 6.00018.000 miligramos por día Dosis que
  ingiere Linus Pauling.10
• 3.000200.000 miligramos por día Robert Cathcart
  va subiendo la dosis hasta que aparece una
  diarrea. Entonces recomienda la dosis más elevada
  que no cause diarrea al paciente.11

53
Efectos Adversos

• Se considera que las necesidades diarias de ácido
  ascórbico para un adulto no exceden de los 60 mg
  y que cantidades superiores a los 3 g diarios
  causan acidificación de la orina e incrementan el
  consiguiente riesgo de cálculos urinarios

54
Otros Usos

• El ácido ascórbico y sus sales ascorbatos de
  sodio, potasio y calcio se utilizan de forma
  generalizada como antioxidantes y aditivos. Estos
  compuestos son solubles en agua por lo que no
  protegen a las grasas de la oxidación para este
  propósito pueden utilizarse los ésteres del ácido
  ascórbico solubles en grasas con ácidos grasos de
  cadena larga (palmitato y estearato de
  ascorbilo).
• Principales fuentes naturales
• Las principales fuentes naturales de vitamina C
  que actualmente se conocen son todas vegetales,
  principalmente ciertas frutas (las que poseen
  colores rojos o azulados suelen ser ricas en
  ácido ascórbico), a continuación se enumeran los
  principales vegetales que hacen aporte de esta
  vitamina " grosella negra (Ribes nigrum), los
  ajís, chiles, pimientos, morrones, pimentones, el
  perejil, la guayaba, el fruto kiwi, el brécol o
  broccoli (Brassica oleracea italica), el híbrido
  llamado loganberry, la grosella (Ribes rubrum) el
  repollito de Bruselas también conocido como col
  de Bruselas, el goji (Lycium barbarum), el lichi
  (Litchi chinensis) entre otros, sin embargo en
  gran parte del mundo de cultura "Occidental" las
  fuentes más comunes para obtener vitamina C
  suelen ser los citrus limón, naranja, pomelo,
  bergamota y, fuera de los citrus, el tomate.

55

• la vitamina C es una de las vitaminas que
  intervienen en el funcionamiento del sistema
  inmunológico, como lo hacen la vitamina A y la
  tiamina. También es muy importante como vitamina
  antioxidante, lo que de una u otra manera protege
  a nuestro organismo de radicales libres u otras
  sustancias tóxicas. Por otro lado, al ser
  hidrosoluble, el exceso es fácilmente eliminado
  en la orina.
• Como curiosidad puede señalarse que esta vitamina
  sólo es esencial en unos pocos animales los
  monos antropoides, el ser humano que ha perdido
  la capacidad de sintetizarla naturalmente en su
  cuerpo el ruiseñor chino, una especie de trucha,
  los cuyes y los murciélagos frugívoros.
• Tipos de vitamina
• La vitamina C se divide en naturales y
  sintéticas. Las naturales se dividen en ácido
  ascórbico y ascorbato de sodio por su parte las
  sintéticas pueden tener distintas variaciones.
• Las ventajas de la vitamina C sintéticas es su
  bajo precio y su fabricación pues su materia
  prima es el petróleo, sus desventajas son su baja
  efectividad y los efectos secundarios que
  conlleva el consumo de elementos minerales en
  reemplazo de vegetales.
• En cambio, la vitamina C natural es sumamente
  efectiva, y de muy bajo precio pues está presente
  en casi toda las frutas y vegetales (cítricos de
  preferencia) su problema radica en que al
  extraerse y convertirse en cristales toma un
  fuerte sabor a limón no bien tolerado por
  personas con sensibilidad en su estomago

56
REFERENCIAS

• Association of Official Analytical Chemists
  985.33 (1995)
• United State Pharmacopeia U.S.P. XXIII
• Methods for the determination of vitamins in
  food, G. Brubacher Muller Mulot and A.T. Southgate

57
Selectividad Ácido Ascórbico Método J.Tillman

• La determinación oxidimétrica no es muy
  selectiva ya que la presencia de otros analitos
  interferentes (compuestos reductores, SO2,etc)
  tienden a producir gastos elevados del titulante
  2,6DFIF, con lo cual generalmente da como
  resultados valores sobreestimados.

58
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE

• El método es aplicable a productos con o sin
  almidón productos heterogéneos, verduras,
  frutas, leche y productos a base de leche.

59
Reactivos

• 1.- Ácido L() ascórbico estándar
• 2.- Ácido meta-fosfórico p.a
• 3.- Ácido acético p.a
• 4.- 2,6-diclorofenol-indofenol sal sódica p.a
• 5.- EDTA sal sódica del ácido etilendiaminotetraac
  ético.
• 6.- Solución estándar de ácido ascórbico.-
  1mg/mL. Pesar con exactitud 50 mg de Acido L()
  ascórbico estándar (U.S.P., B.P.). Transferir a
  un matraz volumétrico de 50 mL. Diluir al volumen
  con la solución de ácido meta-fosfórico al 2.
• 7.- Solución ácido meta-fosfórico.- Disolver con
  agitación 15 mg de pellets de HPO3 glacial en 40
  mL de ácido acético glacial y 150 mL de H2O.
  Aforar a 250 mL con H2O y filtrar rápidamente a
  través de un papel filtro plegado cuantitativo
  (Whatman Nº 541, rápido, 18,5 cm u otro
  equivalente).
• 8.- Solución de EDTA.- Disolver con agitación 0,9
  g de EDTA en 200 mL de H2O.
• 9.- Solución precipitante.- Mezclar
  inmediatamente antes de su uso en volúmenes
  iguales de la solución de EDTA y ácido
  meta-fosfórico.

60
Extracción

• Extracción del ácido ascórbico mediante ácido
  meta-fosfórico, en donde el ácido ascórbico
  reduce el indicador de oxido-reducción
  2,6-diclorofenol-indofenol, eliminando el color
  azul inicial del compuesto en estado sólido en
  solución neutra y alcalina la solución en medio
  ácido es de coloración rosada y se reduce al
  derivado leuco, incoloro, el ácido ascórbico se
  oxida a ácido dehidroascórbico, lo cual permite
  su determinación por volumetría oxidimétrica

61
Solución estándar 2,6-dicloro fenol-indo fenol
sal sódica p.a.

• Disolver 0,0625 de sal sódica en 50 mL de H2O en
  un matraz volumétrico de 250 mL al cual se le
  adiciona previamente 0,0525 g de NaHCO3 grado
  reactivo. Agite vigorosamente, cuando el
  colorante esté disuelto, diluya a 250 mL con H2O.
  Filtrar a una botella ámbar utilizando el papel
  filtro. Guardar bajo refrigeración.

62
Valoración del título de la solución de 2,6
diclorofenol-indofenol sal sódica

• Transfiera 2,0 mL de solución estándar Acido L()
  ascórbico a cada uno de los 3 matraces erlenmeyer
  que contienen 5 mL de la solución precipitante
  cada uno.
• Empleando una bureta de 25 mL graduada en 0,05 mL
  y con una llave de vidrio o teflón, titular
  rápidamente con la solución estándar de indofenol
  hasta obtener una coloración rosada pálida que
  persista por 5 segundos.(Cada titulación debe
  requerir aproximadamente 15 mL, y debe
  corroborarse dentro de ? 0,1 mL).
• Titule 3 blancos compuestos de 7 mL de solución
  precipitante más 15 mL de H2O. El blanco promedio
  es 0,1 mL.
• Calcule el equivalente del colorante indofenol
  (F), equivalente a ácido ascórbico de un mL de la
  solución estándar de indofenol.
• mL DFIF de la titulación del estándar de ácido
  ascórbico - mL DFIF de la titulación del blanco
  mL DFIF equivalente a 2 mg de ácido ascórbico (A)

63

Productos sin o con poco almidón, Ej.leche en
polvo

• Preparación de la porción de ensayo.
• Pesar 10 g con una precisión de 0,1 g una
  cantidad del producto a analizar que contenga
  aproximadamente 5 a 10 mg de ácido ascórbico en
  un matraz de 100 mL con H2O.
• Pipetear 20-40 mL de la disolución y un volumen
  igual de la solución precipitante a un vaso de
  precipitado de 125 mL. Designar el volumen como v
  y el de la disolución de la muestra como E.
• Mezclar y centrifugar a 5.000 rpm por 5 - 10 min.
• Filtrar el sobrenadante utilizando papel filtro.
  
• Designar al filtrado como la solución de ensayo.
  La preparación debe realizarse inmediatamente
  antes de la determinación.

64
Productos heterogéneos

• Ej. verdura, fruta
• Homogeneizar una muestra de 50 a 100 g con un
  volumen de ácido meta-fosfórico de 10
  representando 1/5 del volumen total es decir 50
  mL de ácido meta-fosfórico para un matraz de 250
  mL y enrasar con H2O destilada.
• Centrifugar y/o filtrar la solución obtenida
  sobre un filtro plegado.

65

Valoración

• Pipetear tres alicuotas de 10 mL, de cada
  solución de ensayo (V), llevar cada una de las
  alicuotas a matraces erlenmeyer separados y
  titular con el DFIF (X).
• En forma similar, titular 2 blancos compuestos
  cada uno de 10 mL de la solución precipitante y
  10 mL de H2O. Además agregué un volumen de H2O
  equivalente a los mL de la solución estándar de
  indofenol usados en la titulación de la solución
  de ensayo.
• Titule con la solución estándar de indofenol
  hasta el mismo color del punto final observado en
  la titulación de la alícuota estándar (B). El
  color rosa debe permanecer a lo menos 5 segundos.

66
Cuantificación e Identificación

• Ejemplo leche en polvo
• mg ácido ascórbico/100 g de muestra (X-B) x
  (A/E) x (V/Y) x (100/0,10)
• donde X mL promedio obtenido en la
  titulación de ensayo
• B mL promedio obtenido de la
  titulación del blanco
• A mg de ácido ascórbico equivalente
  a 1 mL de solución estándar de
  indofenol
• E volumen de la muestra disuelta
• V volumen de la muestra de ensayo
• Y volumen de solución de ensayo
  titulada 10 mL
• (100/0,10) factor para expresar el
  contenido en 100 g de producto final.
• Expresión de Resultados.
• Expresar el contenido de ácido ascórbico en mg
  /100 g de producto final.

67
Parámetros
Sodio Hierro Ácido Ascórbico
Selectividad Buena Buena Relativa (valoración visual oxidimétrica)
Linealidad 0,9968 - 0,995 0,9995 NA
Rangos de linealidad 0,6-3,0 ppm - 0,2-1,5 ppm 0,5-5,0 ppm NA
CV Sistema
Repetibilidad 0,01 0,02 NA
Reproducibilidad 0,1 0,2 NA
CV Método
Repetibilidad 4 2,8 0,7
Reproducibilidad 15 6,5 Entre analistas No exceder de 1,2 mg/50mg/100g
Exactitud (Recuperación) 111-106 100-104
Sensibilidad
LD Menor a 0,2 ppm 0,11 0,25 mg
LC Mayor a 0,2 ppm 0,38 1,5 mg

68
Control de Calidad

• Se efectuarán controles para comprobar la validez
  de los ensayos realizados con el método analítico
  recogido en este procedimiento.
• Nivel I Ensayos de intercomparación,
  utilización de materiales de referencia
  certificados y patrones de referencia
  certificados, según disponibilidad.
• Nivel II Materiales de referencia con o sin
  certificación externa y muestras fortificadas por
  el analista en la validación.
• Nivel III. Durante el desarrollo de la serie de
  trabajo se incluye
• Control de blanco al inicio de las lecturas
• Control de estándar de concentración conocida
• Repetición del estándar como control por cada
  diez muestras.