Title: Imobilizace a
1Imobilizace a stabilizace enzymu
2Použití rozpustných enzymu
- Nevýhody
- Jednorázová aplikace
- Nízká stabilita rozpustného enzymu
- Znacne drahé
- Možné rešení
- Imobilizace enzymu
3Imobilizace enzymu
- Definice enzymy, které jsou fyzikálne uzavreny v
omezené oblasti za zachování jejich enzymové
aktivity, a které mohou být použity opakovane a
kontinuálne
4Imobilizace enzymu
- Imobilizace je proces, který prevádí rozpustný
biopolymer (enzym) na formu nerozpustnou nebo
oddelenou ? vetšinou tvorba heterogenního
biokatalyzátoru - Vazba na pevný nosic, zabudování do
(bio)polymeru, vazba na membrány, zesítení... - Zvýšení stability imobilizovaného enzymu
- Odpadá nárocná izolace produktu (z heterogenní
smesi je možno získat produkt po filtraci,
centrifugaci ....) - Imobilizovaný enzym je možno použít opakovane
- Enzymové procesy mohou být provádeny kontinuálne
- Imobilizace muže pozitivne ovlivnit stabilitu
enzymu
5Imobilizace enzymu
- Podmínka úspešného použití imobilizovaných enzymu
? dostatecný kontakt reaktantu s katalyzátorem - Nejcastejší usporádání ? reaktant (a následný
produkt) je ve vodné fázi, která prochází pres
pevnou fázi obsahující katalyzátor - Existují prípady, kdy je reaktant ve fázi
plynné nebo v kapalné fázi, která je nemísitelná
s vodou
6Metody imobilizace
- Vazba na pevné nosice požadavky
- Velký povrch
- Hydrofilní charakter
- Nerozpustnost
- Chemická, mechanická a teplotní stabilita
- Vhodný tvar a velikost cástic
- Odolnost proti mikrobiálnímu pusobení
- Možnost opakovaného použití
7Vazba na pevné nosice
- Fyzikální adsorpce nejstarší metoda imobilizace
(1916 invertasa na alumine) ? casto dochází k
uvolnování enzymu - Vazba na ionexy (nutná volba optimálního pH pro
navázání) - Kovalentní imobilizace na nosice nesoucí vhodné
funkcní skupiny
8Príklad kovalentní imobilizace
- Nosic nesoucí aminoskupiny, aktivace
glutaraldehydem, vazba enzymu pres aminoskupinu
9Skupiny v molekulách proteinu využitelné pro
kovalentní imobilizaci
- -NH2 (N-koncová, e-NH2 lysinového zbytku)
- -COOH (C-koncový, ß-, ?- COOH asparagové a
glutamové kys.) - -SH cysteinu
- -OH serinu a tyrosinu
- cyklický systém tyrosinu a histidinu
10Oxidace polysacharidu
- Polysacharidová matrice oxidovaná jodistanem
- Reakce s aminoskupinou proteinu
11Epoxidová metoda
- Reakce polysacharidové matrice (celulosa,
agarosa, dextran) s epichlorhydrinem ? tvorba
glycidového derivátu (obsahuje oxiranový kruh) - Reakce s NH2, SH skupinou enzymu
12Orientovaná a náhodná imobilizace
13Zesítení
- Reakce molekul enzymu s bifunkcním cinidlem
(napr. glutaraldehyd) - Navázání aminoskupin patrících k ruzným molekulám
enzymu ? zesítení ? tvorba nerozpustného produktu
14Zabudování enzymu
- Zabudování enzymu do struktury (bio)polymerního
gelu - Zabudování enzymu do polopropustné membrány
15Zabudování enzymu do gelu
- Používané gely
- Polyakrylamid
- Alginát (Na forma je rozpustná ? prevod do
nerozpustné Ca2 formy) - Karrageenan (jednomocné ionty (napr. K) zpusobí
prevod do nerozpustné formy) - Agarosa (tekutá pri 45 50 C), prevod do
nerozpustné formy ochlazením - Želatina (prevod do nerozpustné formy zesítením
glutaraldehydem)
16Zabudování enzymu do membrán
- Umístení enzymu do fyzikálne oddeleného prostredí
? mezi semipermeabilní membrány - Výhoda ? použití enzymu v nativním stavu
- Dutá semipermeabilní vlákna, ultrafiltracní
membrány
17Imobilizace na magnetické nosice
- Magnetické nosice ? polymerní cástice obsahující
magnetické oxidy železa, silanizovaný magnetovec - Príprava podobná jako v prípade nemagnetických
nosicu - Výhoda ? možnost práce v suspenzních systémech,
po skoncení enzymové reakce je možné odstranení
imobilizovaného enzymu pomocí magnetického
separátoru (všechny ostatní složky jsou
diamagnetické)
18Zesítené enzymové krystaly a agregáty
- Príprava krystalu enzymu, následné zesítení
glutaraldehydem - Precipitace proteinu (enzymu) vhodným cinidlem ?
tvorba proteinových agregátu ? následné zesítení
glutaraldehydem
19Stabilizace enzymu
- Enzym zustává v rozpustné forme, váží se ruzné
vysokomolekulární slouceniny - Vazba polysacharidu (napr. dextranu) na molekuly
enzymu ? tvorba umelých glykoproteinu
(glykoproteiny jsou obvykle stabilnejší než
neglykosylované proteiny) - Prídavek nízko- nebo vysokomolekulárních látek do
prostredí (anorganické ionty, polyethylenglykol,
polyoly ...)
20Aplikace imobilizovaných enzymu
- Použití imobilizovaných enzymu pro provedení
specifických reakcí ve vhodných reaktorech - míchané reaktory
- plnené kolony
- fluidní lože
- ultrafiltracní membránové systémy
- Použití pri príprave antibiotik, steroidních
látek, specifických aminokyselin
21Imobilizace a nanotechnologie
- Zabudování enzymu do nanopóru vhodných nosicu
- Stabilizace pomocí iontových interakcí
- Takto zabudované enzymy jsou velmi stabilní po
dlouhou dobu
J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 11242-3