Imobilizace a

1
Imobilizace a stabilizace enzymu
2
Použití rozpustných enzymu

• Nevýhody
• Jednorázová aplikace
• Nízká stabilita rozpustného enzymu
• Znacne drahé
• Možné rešení
• Imobilizace enzymu

3
Imobilizace enzymu

• Definice enzymy, které jsou fyzikálne uzavreny v
  omezené oblasti za zachování jejich enzymové
  aktivity, a které mohou být použity opakovane a
  kontinuálne

4
Imobilizace enzymu

• Imobilizace je proces, který prevádí rozpustný
  biopolymer (enzym) na formu nerozpustnou nebo
  oddelenou ? vetšinou tvorba heterogenního
  biokatalyzátoru
• Vazba na pevný nosic, zabudování do
  (bio)polymeru, vazba na membrány, zesítení...
• Zvýšení stability imobilizovaného enzymu
• Odpadá nárocná izolace produktu (z heterogenní
  smesi je možno získat produkt po filtraci,
  centrifugaci ....)
• Imobilizovaný enzym je možno použít opakovane
• Enzymové procesy mohou být provádeny kontinuálne
• Imobilizace muže pozitivne ovlivnit stabilitu
  enzymu

5
Imobilizace enzymu

• Podmínka úspešného použití imobilizovaných enzymu
  ? dostatecný kontakt reaktantu s katalyzátorem
• Nejcastejší usporádání ? reaktant (a následný
  produkt) je ve vodné fázi, která prochází pres
  pevnou fázi obsahující katalyzátor
• Existují prípady, kdy je reaktant ve fázi
  plynné nebo v kapalné fázi, která je nemísitelná
  s vodou

6
Metody imobilizace

• Vazba na pevné nosice požadavky
• Velký povrch
• Hydrofilní charakter
• Nerozpustnost
• Chemická, mechanická a teplotní stabilita
• Vhodný tvar a velikost cástic
• Odolnost proti mikrobiálnímu pusobení
• Možnost opakovaného použití

7
Vazba na pevné nosice

• Fyzikální adsorpce nejstarší metoda imobilizace
  (1916 invertasa na alumine) ? casto dochází k
  uvolnování enzymu
• Vazba na ionexy (nutná volba optimálního pH pro
  navázání)
• Kovalentní imobilizace na nosice nesoucí vhodné
  funkcní skupiny

8
Príklad kovalentní imobilizace

• Nosic nesoucí aminoskupiny, aktivace
  glutaraldehydem, vazba enzymu pres aminoskupinu

9
Skupiny v molekulách proteinu využitelné pro
kovalentní imobilizaci

• -NH2 (N-koncová, e-NH2 lysinového zbytku)
• -COOH (C-koncový, ß-, ?- COOH asparagové a
  glutamové kys.)
• -SH cysteinu
• -OH serinu a tyrosinu
• cyklický systém tyrosinu a histidinu

10
Oxidace polysacharidu

• Polysacharidová matrice oxidovaná jodistanem
• Reakce s aminoskupinou proteinu

11
Epoxidová metoda

• Reakce polysacharidové matrice (celulosa,
  agarosa, dextran) s epichlorhydrinem ? tvorba
  glycidového derivátu (obsahuje oxiranový kruh)
• Reakce s NH2, SH skupinou enzymu

12
Orientovaná a náhodná imobilizace
13
Zesítení

• Reakce molekul enzymu s bifunkcním cinidlem
  (napr. glutaraldehyd)
• Navázání aminoskupin patrících k ruzným molekulám
  enzymu ? zesítení ? tvorba nerozpustného produktu

14
Zabudování enzymu

• Zabudování enzymu do struktury (bio)polymerního
  gelu
• Zabudování enzymu do polopropustné membrány

15
Zabudování enzymu do gelu

• Používané gely
• Polyakrylamid
• Alginát (Na forma je rozpustná ? prevod do
  nerozpustné Ca2 formy)
• Karrageenan (jednomocné ionty (napr. K) zpusobí
  prevod do nerozpustné formy)
• Agarosa (tekutá pri 45 50 C), prevod do
  nerozpustné formy ochlazením
• Želatina (prevod do nerozpustné formy zesítením
  glutaraldehydem)

16
Zabudování enzymu do membrán

• Umístení enzymu do fyzikálne oddeleného prostredí
  ? mezi semipermeabilní membrány
• Výhoda ? použití enzymu v nativním stavu
• Dutá semipermeabilní vlákna, ultrafiltracní
  membrány

17
Imobilizace na magnetické nosice

• Magnetické nosice ? polymerní cástice obsahující
  magnetické oxidy železa, silanizovaný magnetovec
• Príprava podobná jako v prípade nemagnetických
  nosicu
• Výhoda ? možnost práce v suspenzních systémech,
  po skoncení enzymové reakce je možné odstranení
  imobilizovaného enzymu pomocí magnetického
  separátoru (všechny ostatní složky jsou
  diamagnetické)

18
Zesítené enzymové krystaly a agregáty

• Príprava krystalu enzymu, následné zesítení
  glutaraldehydem
• Precipitace proteinu (enzymu) vhodným cinidlem ?
  tvorba proteinových agregátu ? následné zesítení
  glutaraldehydem

19
Stabilizace enzymu

• Enzym zustává v rozpustné forme, váží se ruzné
  vysokomolekulární slouceniny
• Vazba polysacharidu (napr. dextranu) na molekuly
  enzymu ? tvorba umelých glykoproteinu
  (glykoproteiny jsou obvykle stabilnejší než
  neglykosylované proteiny)
• Prídavek nízko- nebo vysokomolekulárních látek do
  prostredí (anorganické ionty, polyethylenglykol,
  polyoly ...)

20
Aplikace imobilizovaných enzymu

• Použití imobilizovaných enzymu pro provedení
  specifických reakcí ve vhodných reaktorech
• míchané reaktory
• plnené kolony
• fluidní lože
• ultrafiltracní membránové systémy
• Použití pri príprave antibiotik, steroidních
  látek, specifických aminokyselin

21
Imobilizace a nanotechnologie

• Zabudování enzymu do nanopóru vhodných nosicu
• Stabilizace pomocí iontových interakcí
• Takto zabudované enzymy jsou velmi stabilní po
  dlouhou dobu

J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 11242-3