B I O T E C N O L O G

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B I O T E C N O L O G Í A

• Ingeniería genética

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BIOTECNOLOGÍA

• Visión general
• En la práctica

Utilización de los seres vivos para beneficio
humano

• Producción de alimentos y bebidas
• Obtención de medicamentos

La ingeniería genética puede definirse como un
conjunto de técnicas, nacidas de la Biología
molecular, que permiten manipular el genoma de un
ser vivo.

• Clonación, mapas genéticos,
• Organismos transgénicos, terapia génica

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INGENIERÍA GENÉTICA

1. Tecnología de ADN recombinante
2. Clonación y expresión de genes
3. Aplicaciones

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PROCESO(ADN recombinante)

1. Fragmentar y aislar el ADN
2. Unión a vectores.
3. Introducción en las células.
4. Clonación
5. Búsqueda del clon idóneo.
6. Análisis del ADN clonado transferencia Southern,
7. Secuenciación.
8. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

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FRAGMENTACIÓN DEL ADN

• Por endonucleasas de restricción
• Las enzimas de restricción, también conocidas
  como endonucleasas, son enzimas que cortan los
  enlaces fosfodiester del material genético a
  partir de una secuencia que reconocen.
• Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble,
  donde reconocen secuencias palindrómicas
  (secuencias que se leen igual en ambas
  direcciones).
• Son extraídas de organismos procarióticos
  (bacterias), donde actúan como un mecanismo de
  defensa, para degradar material genético extraño
  que entre en la célula. Las bacterias tienen la
  capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para
  distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio.
  Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA
  metilado, de este modo solo afectan el DNA
  extranjero y no el DNA bacterial.

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ACCIÓN DE ENDONUCLEASAS

• Generan extremos cohesivos.
• Si se actúa sobre dos ADNs diferentes con la
  misma endonucleasa, al juntarlos se unirían
  espontáneamente.

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IMÁGENES DE ACCIÓN
ENDONUCLEASAS
ADN
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EN DETALLE
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MAPA DE RESTRICCIÓN
Mapa físico de un segmento de ADN que muestra los
lugares de corte de endonucleasas específicas y
la distancia entre pares de bases.
Indica puntos de corte Se reflejan determinadas
secuencias de nucleótidos. Permite comparar ADNs
y ver su similitud (detección de mutaciones)
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EJERCICIO 1

• Un fragmento lineal de ADN de 7Kb se corta por
  separado con dos endonucleasas de restricción y
  luego con una mezcla de ambas obteniéndose los
  fragmentos indicados a continuación 

Endonucleasa de restricción Tamaño de los fragmentos (Kb)
EcoRI 3.0 y 4.0
HaeIII 2.0 y 5.0
EcoRI HaeIII 2.0 , 1.0 y 4.0
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EJERCICIO 1 - Solución
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APLICACIÓN MAPA RESTRICCIÓN

• Permite diferencias ADNs de individuos de
  diferentes especies.
• POLIMORFISMO DE LONGITUD DE FRAGMENTOS DE
  RESTRICCIÓN (RFLP) (cada individuo tiene
  diferente colección de fragmentos para la acción
  de una misma colección de endonucleasas)

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2. UNIÓN A VECTORES
Los vectores son estructuras que permiten
introducir material genético en el interior de
otra célula.

• Los vectores deben ser tratados con las mismas
  endonucleasas de restricción.
• Luego se produce la unión del vector con el
  fragmento de ADN a introducir.

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PLÁSMIDOS

• Son moléculas de ADN circular e bacterias.
• Tienen replicación independiente.
• Además, otros genes
• Facilidad para la manipulación.
• Porta marcadores específicos permiten
  diferenciación posteror.

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IMAGEN DE UNIÓN PLÁSMIDO
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FAGOS

• Virus que infectan bacterias (bacteriófagos)
• Transducción incorporan material genético del
  huesped.
• Al infectar otra célula (bacteria) introduce el
  material del antiguo huesped.
• Ej. Bacteriofágo o fago l.

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FAGO LAMBDA

• Un vector ampliamente usado para crear DNA
  recombinante.
• 48,502 pares de bases de longitud.
• Usualmente un DNA recombinante de lambda tiene
  80 DNA del vector y 20 del DNA insertado.

CICLO DE UN VIRUS
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CÓSMIDOS

• Fragmentos de ADN que llevan un ADN no propio y
  el sitio COS. (similares a plásmidos)
• Sitio COS provoca el empaquetamiento del ADN.
• Conclusión permite transportar grandes
  cantidades de ADN.

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OTROS

• Cromosomas artificiales de levadura YACs
• Retrovirus
• Cromosomas humanos artificiales HACs

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RESUMEN VECTORES
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4. CLONACIÓN

• Sacar copias del ADN que se ha unido al vector.
• Se utiliza un huesped
• Capacidad de crecimiento rápido.
• No ser dañino o patógeno
• Ser capaz de aceptar el ADN exógeno y que éste
  permanezca estable.
• El huésped debe tener enzimas para la replicación
  del vector.
• Bacterias E. coli y B. subtillis.

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Escherichia coli como vector

• Potencialmente patógeno
• Producción de endotoxinas.

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CLONACIÓN EN EUCARIOTAS

• EL más utilizado Saccharomyces cerevisiae.
• Es capaz de recibir plásmidos.
• También YACs (cromosomas artificiales de
  levadura)
• Cultivos celulares de mamíferos
• Manejo parecidos a huéspedes bacterianos.
• Ventaja tienen proceso maduración del ARNm y así
  ya es directamente funcional.

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UTILIZACIÓN DE YACs
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5. BÚSQUEDA DEL CLON IDÓNEO

• Hay muchos tipos de bacterias transformadas.
• Cuál tiene el fragmento de ADN exógeno que nos
  interesa?
• Se saca réplica en membrana.
• Se desnaturaliza ADN con NaOH.

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5. BÚSQUEDA DEL CLON IDÓNEO

• Se desnaturaliza el ADN con NaOH.
• Se añade sonda radioactiva complementaria al gen
  que se quiere buscar.
• Se lava el ADN monohebra (sólo queda el híbrido)
• Se pone placa fotográfica.

Biblioteca genómica
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APLICACIÓN MÉDICA OBTENCIÓN DE LA INSULINA
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6. IDENTIFICACIÓN DE GENES - Southern

• Es un mecanismo mediante el cual se pueden
  identificar genes que se encuentren en fragmentos
  de restricción.
• Aplicación
• Diagnóstico de enfermedades
• Huella genética
• Concepto previo electroforesis

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ELECTROFORESIS EN GEL

• Gel de Agarosa (polímero de galactosa)
• Se ponen en pozitos en un extremos los
  fragmentos de ADN
• Se somete a un campo eléctrico (grupos fosfato
  son arrastrados al polo )
• Fragmentos más grandes emigran menos. Los
  pequeños más.

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MÉTODO SOUTHERN

1. Electroforesis en gel (separación de fragmentos
   por tamaño)
2. Desnaturalización (a ADN de cadena sencilla)
3. Transferencia a filtro de nitrocelulosa (los
   papeles secantes absorben el tampón y los ADN
   monohebra se pegan al filtro)
4. Hibridación con sondas marcadas P32.
5. Eliminación de sondas no unidas.
6. Exposición a la película fotográfica y revelado
7. Identificación de fragmentos

V E R
V E R 2
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AMPLIFICACIÓN PCR

• Objetivo obtener millones de copias en poco
  tiempo de fragmentos de ADN.
• Se basa en el enzima , obtenida de
  Thermobacillus.
• Sólo se necesita conocer la secuencia de los
  extremos para fabricar cebadores.
• Tras varios ciclos se forman millones de copias.

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AMPLIFICACIÓN POR PCR
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POLIMERASA CHAIN REACTION
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CADENA DE REACCIÓN DE LA POLIMERASA - 1
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PCR 2
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CICLO DE UN VIRUS
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SOUTHERN
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Método southern
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• Producción de alimentos y bebidas
• Obtención de medicamentos