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FABIANA SEIXAS

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Title: Engenharia Gen tica Author: Odir A. Dellagostin Last modified by: Fabiana Seixas Created Date: 10/1/1997 2:01:04 AM Document presentation format – PowerPoint PPT presentation

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Title: FABIANA SEIXAS


1
BIBLIOTECAS DE DNA ou BANCOS DE DNA
FABIANA SEIXAS email fabianak_at_ufpel.edu.br
2
TIPOS DE VETORES
3
VETORES PLASMIDIAIS
  • Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita
    dupla, extracromossômico, que ocorrem
    naturalmente em bactérias e algumas leveduras
  • pUC18
  • pBR322
  • pUP310
  • Ob. Utilizados para clonar fragmentos de até 9kb

4
BACTERIÓFAGO
  • Vírus que infectam bactérias
  • DNA ou RNA
  • Capsídeo
  • Biologia do fago
  • Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a 25 kb

5
COSMÍDEOS
  • São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos
  • - Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35
    kb

6
DNA RECOMBINANTE
7
(No Transcript)
8
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
  • É uma coleção de clones que representam a
    totalidade do genoma de um determinado organismo
  • Consiste de todas as moléculas de DNA
    recombinantes que foram geradas pela ligação do
    DNA do organismo a um vetor (plasmideo,
    bacteriófago ou cosmídeo)
  • Servem para isolar DNA específicos de um organismo

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BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
CARACTERÍSTICAS
  • São usadas principalmente para procariotos
  • Em eucariotos usa-se biblioteca genômica para
    estudo de regiões reguladoras
  • Independe do tipo de célula utilizada para a
    obtenção do DNA

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BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
- Representa todo o genoma de um organismo
11
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO - Fagos
12
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
13
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO - Aplicações
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BIBLIOTECAS DE cDNA
BIBLIOTECAS DE cDNA
  • É o conjunto de clones das seqüências
    codificadoras que estão sendo expressas pela
    célula naquele momento, obtido através da
    clonagem de moléculas cópias do mRNA.
  • É usada principalmente para células eucarióticas.
  • Varia de acordo com o tecido utilizado.

15
BIBLIOTECAS DE cDNA
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SINTESE DE cDNA
Purificação do RNA
Hibridização com poly(dT)
Copia do DNA com RT
Degradação do RNA
Síntese de uma fita complementar
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BIBLIOTECAS DE cDNA
18
BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
Clonagem de cDNA em fago ?
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BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
Etapas na construção de uma Biblioteca genômica e
de cDNA
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BIBLIOTECAS
DIFERENÇAS
  • Biblioteca genômica
  • Representam uma amostra aleatória de todas as
    seqüências de DNA de um organismo
  • Biblioteca de cDNA
  • Contém moléculas que foram transcritas em mRNA
  • Produção de grande quantidade de mRNA por
    células especializadas
  • Varia de acordo com tipo e estado fisiológico
    da célula
  • mRNA é processado

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BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
Utilização de bibliotecas
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TRIAGEM DE UMA BIBLIOTECA
  • Detecção do produto do gene pela utilização de
    anticorpos
  • Detecção do DNA através da técnica de hibridização

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Triagem de uma biblioteca
24
1- Detecção do produto do gene pelo uso de
anticorpos
Triagem de uma biblioteca
25
1- Detecção do produto do gene pelo uso de
anticorpos
Triagem de uma biblioteca
26
Triagem de uma biblioteca
2- Detecção do DNA através da técnica de
hibridização
HIBRIDIZAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
  • É a formação de molécula fita dupla, através do
    pareamento de duas fitas de DNA ou uma de DNA e
    outra de RNA complementares, mas de origens
    diferentes
  • Hibridização ? Renaturação

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Triagem de uma biblioteca
SONDA de DNA - Seqüência de DNA Marcada
  • Marcação da Sonda de DNA
  • Radioativa 32P nick traslation
  • Enzimática peroxidase, fosfatase alcalina

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Triagem de uma biblioteca
Marcação da Sonda de DNA Radioativa 32P nick
traslation
Atividade Exonucleasica da DNA polimerase
DNA polimerase preenche com nucleotídeos marcados
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Triagem de uma biblioteca
  • Marcação da Sonda de DNA
  • Enzimática peroxidase, fosfatase alcalina

Desnaturação DNA
DNA fita simples
peroxidase complexada com polimero positivo
Ligação Fraca (DNA Peroxidase)
glutaraldeído
Sondas Covalentemente marcada com a enzima
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2- Detecção do DNA através da técnica de
hibridização
Triagem de uma biblioteca
Placas com Colônias contendo os plasmídeos
Lise das Bactérias Desnaturação do DNA
1
3
2
4
5
6
Sonda
Filme de Raio - X
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2- Detecção do DNA através da técnica de
hibridização
Triagem de uma biblioteca
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Caracterização da seqüência encontrada
Triagem de uma biblioteca
  • Seqüenciamento de DNA
  • PCR
  • Expressão da sequência codificadora

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Técnicas de Hibridização
Southern Blot - DNA Northern Blot - RNA Western
Blot - Proteína
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Southern Blot RNA
  • Sonda seqüência de DNA marcada

Transferência de DNA do gel para a membrana
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Northern Blot RNA
4. Geração de uma sonda marcada
1. Extração do DNA
dATP
dGTP
dTTP
dCTP
pGEM-T
2. Eletroforese do RNA
5. Hibridização
6. Visualização
3. Transferencia para a menbrana
36
Trabalho Prático 1
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