Title: FABIANA SEIXAS
1BIBLIOTECAS DE DNA ou BANCOS DE DNA
FABIANA SEIXAS email fabianak_at_ufpel.edu.br
2TIPOS DE VETORES
3VETORES PLASMIDIAIS
- Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita
dupla, extracromossômico, que ocorrem
naturalmente em bactérias e algumas leveduras - pUC18
- pBR322
- pUP310
- Ob. Utilizados para clonar fragmentos de até 9kb
4BACTERIÓFAGO
- Vírus que infectam bactérias
- DNA ou RNA
- Capsídeo
- Biologia do fago
- Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a 25 kb
5COSMÍDEOS
- São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos
- - Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35
kb
6DNA RECOMBINANTE
7(No Transcript)
8BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
- É uma coleção de clones que representam a
totalidade do genoma de um determinado organismo - Consiste de todas as moléculas de DNA
recombinantes que foram geradas pela ligação do
DNA do organismo a um vetor (plasmideo,
bacteriófago ou cosmídeo) - Servem para isolar DNA específicos de um organismo
9BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
CARACTERÍSTICAS
- São usadas principalmente para procariotos
- Em eucariotos usa-se biblioteca genômica para
estudo de regiões reguladoras - Independe do tipo de célula utilizada para a
obtenção do DNA
10BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
- Representa todo o genoma de um organismo
11BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO - Fagos
12BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
13BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO - Aplicações
14BIBLIOTECAS DE cDNA
BIBLIOTECAS DE cDNA
- É o conjunto de clones das seqüências
codificadoras que estão sendo expressas pela
célula naquele momento, obtido através da
clonagem de moléculas cópias do mRNA. - É usada principalmente para células eucarióticas.
- Varia de acordo com o tecido utilizado.
15BIBLIOTECAS DE cDNA
16SINTESE DE cDNA
Purificação do RNA
Hibridização com poly(dT)
Copia do DNA com RT
Degradação do RNA
Síntese de uma fita complementar
17BIBLIOTECAS DE cDNA
18BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
Clonagem de cDNA em fago ?
19BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
Etapas na construção de uma Biblioteca genômica e
de cDNA
20BIBLIOTECAS
DIFERENÇAS
- Biblioteca genômica
- Representam uma amostra aleatória de todas as
seqüências de DNA de um organismo - Biblioteca de cDNA
- Contém moléculas que foram transcritas em mRNA
- Produção de grande quantidade de mRNA por
células especializadas - Varia de acordo com tipo e estado fisiológico
da célula - mRNA é processado
21BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO
Utilização de bibliotecas
22TRIAGEM DE UMA BIBLIOTECA
- Detecção do produto do gene pela utilização de
anticorpos - Detecção do DNA através da técnica de hibridização
23Triagem de uma biblioteca
241- Detecção do produto do gene pelo uso de
anticorpos
Triagem de uma biblioteca
251- Detecção do produto do gene pelo uso de
anticorpos
Triagem de uma biblioteca
26Triagem de uma biblioteca
2- Detecção do DNA através da técnica de
hibridização
HIBRIDIZAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
- É a formação de molécula fita dupla, através do
pareamento de duas fitas de DNA ou uma de DNA e
outra de RNA complementares, mas de origens
diferentes - Hibridização ? Renaturação
27Triagem de uma biblioteca
SONDA de DNA - Seqüência de DNA Marcada
- Marcação da Sonda de DNA
- Radioativa 32P nick traslation
- Enzimática peroxidase, fosfatase alcalina
28Triagem de uma biblioteca
Marcação da Sonda de DNA Radioativa 32P nick
traslation
Atividade Exonucleasica da DNA polimerase
DNA polimerase preenche com nucleotídeos marcados
29Triagem de uma biblioteca
- Marcação da Sonda de DNA
- Enzimática peroxidase, fosfatase alcalina
Desnaturação DNA
DNA fita simples
peroxidase complexada com polimero positivo
Ligação Fraca (DNA Peroxidase)
glutaraldeído
Sondas Covalentemente marcada com a enzima
302- Detecção do DNA através da técnica de
hibridização
Triagem de uma biblioteca
Placas com Colônias contendo os plasmídeos
Lise das Bactérias Desnaturação do DNA
1
3
2
4
5
6
Sonda
Filme de Raio - X
312- Detecção do DNA através da técnica de
hibridização
Triagem de uma biblioteca
32Caracterização da seqüência encontrada
Triagem de uma biblioteca
- Seqüenciamento de DNA
- PCR
- Expressão da sequência codificadora
33Técnicas de Hibridização
Southern Blot - DNA Northern Blot - RNA Western
Blot - Proteína
34Southern Blot RNA
- Sonda seqüência de DNA marcada
Transferência de DNA do gel para a membrana
35Northern Blot RNA
4. Geração de uma sonda marcada
1. Extração do DNA
dATP
dGTP
dTTP
dCTP
pGEM-T
2. Eletroforese do RNA
5. Hibridização
6. Visualização
3. Transferencia para a menbrana
36Trabalho Prático 1