Induction de lexpression de lactivateur tissulaire du plasminogne dans les cellules endothliales par

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Induction de lexpression de lactivateur
tissulaire du plasminogène dans les cellules
endothéliales par le Neovastat, un nouveau
médicament anti-angiogénique.Carine Nyalendo,
Denis Gingras et Richard Béliveau.Laboratoire
de Médecine Moléculaire, Hôpital Sainte-Justine,
Montréal, Canada
Résumé Langiogenèse est un processus
indispensable pour le développement dune
majorité tumeurs et leur dissémination dans
lorganisme. Des agents anti-angiogéniques sont
en cours de développement pour le traitement de
cancers. Nous avons récemment rapporté que le
Neovastat, un extrait de cartilage de requin aux
propriétés anti-angiogéniques, pourrait inhiber
langiogenèse en augmentant lactivité du tPA.
Dans cette étude, nous démontrons que le
Neovastat augmente également la transcription du
gène du tPA dans les BAEC, dune manière
semblable à celle du TNF-a. Les analyses par
RT-PCR et les essais de gène rapporteur utilisant
le promoteur humain du tPA indiquent que
laugmentation de la transcription génique du
tPA, induite aussi bien par le Neovastat que par
le TNF-a, est corrélée avec la phosphorylation
des protéines kinases JNK1/2 et de I?B, suggérant
limplication des voies de signalisation
intracellulaire SAPK/JNK et NF?B dans ce
processus. En effet, SP600125 et BAY11-7082, des
inhibiteurs de JNK et IKK, respectivement,
inhibent laugmentation de la transcription du
gène tPA induite par le Neovastat et TNF-a. Ces
résultats suggèrent que le Neovastat induit la
transcription du gène tPA via lactivation des
voies de signalisation intracellulaire JNK et
NF?B, conduisant à une augmentation de la
sécrétion du tPA. Cette activité causerait la
destruction de la matrice temporaire de fibrine
qui est nécessaire à la formation de nouveaux
vaisseaux sanguins. Les cellules endothéliales
meurent alors par anoikis, ce phénomène
contribuant ainsi aux propriétés
anti-angiogéniques du Neovastat.
Introduction Le rôle de langiogenèse dans la
croissance tumorale Le
Neovastat, un composé multi-fonctionnel Le
Neovastat est un extrait de cartilage de requin
qui est en études cliniques de phase III pour le
traitement du cancer du poumon. Nous
avons récemment démontré que le Neovastat
augmente lactivité in vitro de lActivateur
tissulaire du plasminogène (tPA), une enzyme clé
dans langiogenèse car elle joue un rôle très
important dans la fibrinolyse et la dégradation
de la matrice extracellulaire. Objectifs de
létude Les objectifs de cette étude sont de
déterminer leffet du Neovastat sur lexpression
du tPA dans les cellules endothéliales, et les
mécanismes par lesquels le composé exerce cet
effet. Cette étude est basée sur lhypothèse
selon laquelle, une sur-stimulation de lactivité
du tPA, se traduisant par une dégradation
excessive de la matrice extracellulaire
nécessaire au maintien de lintégrité des
vaisseaux sanguins, entraînerait linhibition de
la néo-formation de vaisseaux sanguins
(angiogenèse).

• Méthodes
• Culture de cellules endothéliales daorte bovine
  (BAEC)
• Zymographie caséine-plasminogène afin de mesurer
  lactivité des activateurs du plasminogène (tPA
  et uPA) sécrétés par les cellules
• Immnuno-buvardage de type Western afin de
  déterminer lexpression des protéines
• RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase
  Reaction Chain) afin de déterminer lexpression
  de lARNm du tPA
• Essai de gène rapporteur afin dévaluer
  lactivité du promoteur du tPA
• Résultats
• Figure 1 Le Neovastat induit la sécrétion et
  les niveaux dARNm de tPA dans les BAEC.

Figure 2 Le Neovastat et TNF-a induisent les
voies de signalisation SAPK/JNK et
NF?B. Les BAEC ont été
traitées avec 100µg/ml de Neovastat (A) ou avec
50 ng/ml de TNF-? (B) durant les périodes de
temps indiquées. Les lysats cellulaires ont été
préparés puis immuno-détectés en utilisant les
anticorps anti phospho-JNK1/2, anti phospho c-jun
et anti phospho-IkB. Les protéines JNK1/2 et IkB
totales ont ensuite été immuno-détectées sur les
mêmes échantillons. Figure 3 Linduction du
gène tPA par le Neovastat seffectue via les
voies de signalisation SAPK/JNK et
NF?B. A. Analyse des niveaux
dARNm par RT-PCR. Les BAEC confluentes à 90 ont
été pré-incubées avec 10 µg/ml dActinomicyne D,
10 µM de SP600125 ou 2 µg/ml de BAY11-7082
pendant 30 minutes. Elles ont ensuite été
incubées en en présence ou absence de 100 µg/ml
de Neovastat ou de 50 ng/ml de TNF-a pendant 4
heures. Les ARNm ont été isolés et soumis à une
RT-PCR, pour amplifier les gènes du tPA et de
lactine. B. Analyse des immuno-détections des
cellules traitées. Les cellules ont été
pré-incubées tel que décrit en A puis incubées
pendant 1 heure (pour la détection de
phospho-JNK1/2 et JNK1/2) ou pendant 4 heures
(pour la détection de phospho- I?B et I?B), en
présence ou en absence de 100 µg/ml de Neovastat
ou 50 ng/ml de TNF-a. Les lysats cellulaires ont
été analysés par immuno-détection de type Western
en utilisant les anticorps anti phospho-JNK1/2 et
phospho-I?B. Les immunobuvardages ont ensuite été
re-détectés avec les anticorps anti JNK1/2 et
I?B.

• Figure 4 Le Neovastat active le promoteur du
  tPA.
• Les BAEC ont été co-transfectées avec les
  vecteurs ptPA.Luc et pSEAP dans un ratio de 50
  pour 1, puis traitées avec 500 µg/ml de
  Neovastat ou 50 ng/ml de TNF-a durant les
  périodes de temps indiquées (A), ou avec des
  concentrations croissantes de Neovastat durant 4
  heures (B), ou pré-incubées ou non avec 10 µM de
  SP600125 ou 2 µg/ml de BAY-11-7082 pendant 30
  minutes, puis incubées ou non avec 500 µg/ml de
  Neovastat pendant 4 heures, ou 50 ng/ml de TNF-a
  pendant 15 minutes (C). . Lactivité de la
  luciférase a été mesurée dans les lysats
  cellulaires par luminescence. Les efficacités de
  transfection ont été standardisées avec
  lactivité de la phosphatase alcaline sécrétée.
• Conclusion

A
B
C