Title: Dtermination de la nature dune protine par spectromtrie de masse
1Détermination de la nature dune protéine par
spectrométrie de masse
Samuele Giani Nadji Salhi
2Introduction
Top-down
- analyse dune protéine native
Bottom-up
- analyse des peptides provenant de la digestion
enzymatique dune protéine
2D-PAGE, Off-gelTM
ESI-MS, MALDI-MS
ICAT
RP-HPLC, CE
3Outils de la protéomique
Électrophorèse sur gel focalisation
isoélectrique
HPLC
Spectrométrie de masse ESI-MS ou
MALDI-MS
4Source ESI
5Source MALDI
6MS Analyseurs
Temps de vol
Trappe d'ions
7Concepts et buts
But Détermination de la nature dune protéine
inconnue
- lidentification seffectue à partir des bases
de données
- méthode Bottom-up et Top-down
Montage expérimental
8Concepts et buts
Le microchip home-made pour ESI
Channel 35?m?30?m?2cm Electrode 25?m?75 ?m
- Cellule électrolytique efficace!
? débits, cône Taylor, volume mort
9Bottom-up
Électrochimie rapide et incomplète
10Bottom-up
Voltammétrie cyclique
MS
Voltammogrammes obtenus sur électrode de carbone
vitreux 3 mm ? À 25 mV s-1 hydroquinoneCystéin
e 2mM
11Bottom-up
Voltammétrie cyclique
MS
Réactions parasites, consécutives, avec O2
Vitesse maximale, pas de réactions parasites
Spécificité avec la Cystéine
12Résultats Top-down
GE
- détermination du pI 4.9 5.4
ESI-TOF-MS
- masse de la protéine native 66400 Da
z1 j(m2-mp)/(m2-m1) M z1(m1-mp)
13Résultats Top-down
TagIdent tool
Database
? ? ? ? ? ? ? ?
14Résultats Bottom-up
Trypsine
- protéolyse après Lys et Arg sauf si après Pro
on génère nombreux peptideslyophilisation
HPLC
Marquage
- électrogéneration de carboxyméthylbenzoquinone
MS
15Résultats Bottom-up
Recherche dans Mascot
Bovine BSA
Database
16Résultats Bottom-up
Peptides non marqués 75 peptides
Taxonomy all entries, 5 missed cleavages
Taxonomy all entries, 2 missed cleavages
BSA score 76
BSA score 60
BSA score 154
BSA score 172
Peptides marqués 75 peptides 23 compxCys
17Résultats Bottom-up
?
Peptides non marqués 75 peptides
BSA score 76
Taxonomy all entries, 2 missed cleavages
Taxonomy other mammalians, 2 missed cleavages
?
Peptides marqués 75 peptides 23 compxCys
BSA score 172
18Résultats Bottom-up
Peptides non marqués 75 peptides
Peptides marqués 75 peptides 23 compxCys
19Conclusions
Marquage électrochimique
- outil pour lidentification des protéines
- méthode on-line 2 informations
- couplage méthodes de séparation
- analyse de plusieurs protéines limités par
outils de bioinformatique
20Remerciements
Dr. Christophe Roussel
Loïc Dayon