Diagnosi immunologica di infezione acuta e latente

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Diagnosi immunologica di infezione acuta e latente

• Myco-09 corso di micobatteriologia avanzata
• DM Cirillo, HSR Milano

2
IGRA

• Interferon Gamma Release Assay
• TEORIA i linfociti T precedentemente
  sensibilizzati con antigeni tubercolari producono
  alte concentrazioni di IFN-gamma quando riesposti
  allo stesso antigene.

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IGRA
Oxford Immunotec T-SPOT.TB
Cellestis QuantiFERON-TB Gold In-Tube
4
Antigeni specifici

• ESAT6
• CFP10
• Presenti in tutti gli organismi del MTB complex
• ASSENTI nel BCG (RD1)
• ASSENTI nella maggior parte dei micobatteri
  non-tubercolari

5
EVIDENZE

• Specificità TST alta in individui non vaccinati,
  bassa o variabile nei vaccinati
• IGRAs alta specificità (QFTgtTspot)
• Specificità gtTST
• Non modificati da BCG
• Molto utili in settings in cui la vaccinazione
  viene ripetuta dopo la nascita
• Sensibilità degli IGRAs variabile rispetto a TST
  e popolazione dipendente
• QFTTST
• QFTgt in popolazioni a bassa incidenza rispetto
  alle popolazioni ad alta incidenza
• Tspot gt sensibilità rispetto a a QTF e TST
• In popolazionei a bassa incidenza correla meglio
  con i livelli di esposizione

6
IGRA Tests specificità

• Pai M, Zwerling A, Menzies D. Ann Int Med 2008
  149
• 177-84
• Review sistematica e aggiornata
• Eccellente specificità del QFT (meno dati
  disponibili sul T-spot commerciale)
• Alta specificità del TST in soggetti non-BCG
  vaccinati ma bassa e variabile in soggetti BCG
  vaccinati
• Sensibilità del TST e degli IGRA test non
  consistente tra test e tra popolazioni
  (differenti)
• ?? T-spot più sensibile del QFT/TST

7
LTBI specificità e sensibilità (Pai 2006)
Sensibilità 75-97 Specificità 92-98
8
IGRA e TB attivaQFT sensibilita TB attiva
55-88TST 33-90elispot 83-95
9
IGRA e EP-TB

• Song 2008
• QFT-G 48 EP-TB casi confermati (110 totali)
• Sensibilità 69
• Specificità 87
• Non può essere utilizzato come unico criterio per
  la diagnosi di EP-TB

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T SPOT TB peptidi utilizzati
17 peptidi ESAT-6
18 peptidi CFP-10
11
QF-TB Gold peptidi utilizzati
6 peptidi CFP-10
1 peptide TB 7.7
7 peptidi ESAT-6
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T-SPOT.TB

• Utilizza gli antigeni TBC-specifici ESAT-6 e
  CFP-10
• Cellule mononucleate vengono estratte da 8 cc di
  sangue (PBMC), isolate ed esposte agli antigeni
  TBC-specifici. Dopo incubazione overnight, si
  contano i linfociti T che producono IFN-?.
• I casi di indeterminati non sono frequenti è un
  test definito laboratory intensive.

13
QuantiFERON-TB Gold In-Tube

• 1ml di sangue intero viene esposto agli antigeni
  ESAT6, CFP10 and TB7.7, al controllo negativo
  (nulla) e positivo (mitogeno) in tre diverse
  provette
• Dopo incubazione overnight il plasma viene
  estratto e la concentrazione di IFN-? determinata
  mediante ELISA.
• Cut-off arbitrario per determinare i risultati
  positivi

14
TST e IGRA
15
IGRA - TST
TEST VANTAGGI SVANTAGGI
TST Molto studiato Trials clinici basati sui risultati del TST Economico 2 visite Specificità inferiore (BCG) Sensibilità inferiore in immunocompromessi operatore dipendente
IGRA Alta specificità Simile sensibilità 1 visita MOLTI DATI CONTRASTANTI Costi (35-120 US) Risultati indeterminati
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Risposta CD4 specifica

• Se un individuo è esposto alla TBC
• Le cellule CD4 dovrebbero reagire a ESAT6 e CFP10
• Queste producono IFN-?
• Che può essere misurato
• - nel siero
• - oppure colorando le cellule reattive

17
(No Transcript)
18
Effector cells are detected by IFN-? tests

• Effector cells produce IFN-? within a few hours
  of stimulation
• Memory cells must proliferate, and take gt24 hours
  before significant IFN-? production
• Most in vitro IFN- ? tests incubate for lt24 hours
  
• ?The IFN-? is from effector T cells

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QuantiFERON-Gold In Tube
Fase 1 Raccolta del sangue
Nil
TBC
Il plasma si conserva per massimo 8 settimane.a
2-8C, per anni a -20C
Centrifugare per 5 min.
Incubazione a 37ºC per16-24 ore
3x1mL campioni sangue

• Opzione 1 Trasporto dei campioni in laboratorio
  entro 16 ore dalla raccolta, prima
  dellincubazione.

• Opzione 2 Trasporto dei campioni in laboratorio
  entro 3 giorni dallincubazione.

• Possibilità di raggruppare i campioni.

20
QuantiFERON-Gold In Tube
Fase 2 Interferone-? ELISA
Incubazione per 120min. a temperatura ambiente
Aggiunta della.stop-solution e lettura
dellassorbanza
Calcolo e stampa dei risultati
Aggiunta di plasma e coniugato
Lavaggio e aggiunta di substrato

• Standard ELISA

• User-friendly software fornito gratuitamente da
  Cellestis

• Non necessita di nuove apparecchiature

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Step 1 Preparazione delle cellule

• Sangue raccolto in tubi Vacutainer CPT
• Centrifugazione dei tubi
• Rimozione dellanello linfocitario
• Lavaggio e conta cellule
• Cellule trasferite su piastra a 96 pozzetti
• Aggiunta degli antigeni nei pozzetti
• Incubazione overnight

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Step 2 Formazione degli spot

• Lavaggio della piastra
• Aggiunta di soluzione coniugato per 60 minuti
• Lavaggio della piastra
• Aggiunta del substrato formazione di spot dopo 7
  minuti
• Lavaggio ed asciugatura della piastra

Neg.
Pos.
23
Step 3 Conta degli spots

• Conta visiva degli spot utilizzando una lente di
  ingrandimento o un microscopio a dissezione
• Come alternativa, utilizzare un elispot reader
  automatizzato
• Piastra inserita nel reader per lettura
  automatica
• Il computer registra tutte le immagini, compila
  in maniera non modificabile un registro di
  controllo, e calcola il numero di spot in ogni
  pozzetto
• Fotocamera e criteri di analisi sono predisposti
  automaticamente

Above Automated T-SPOT plate reader
24
(No Transcript)
25
CDC

• Nelle Guidelines for the Investigation of
  Contacts of Persons with Infectious Tuberculosis
  (CDC Atlanta, 2005) si suggerisce che il QFT-G
  assay POTREBBE essere usato al posto del TST in
  tutti i casi (Dr. Vernon)

26
NICE

• National Institute for Health and Clinical
  Excellence TB guidelines (Regno Unito, 2006) si
  consiglia uno screening iniziale con TST seguito
  da un test IGRA (se disponibile) per i casi TST,
  oppure (se il risultato del TST non è affidabile)
  per la conferma del TST.

27
2007 Canadian Guidelines

• IGRAs are recommended for
• 4. Contacts of active TB
• Close contacts (HIGH RISK) can get both TST and
  IGRA and if either is positive, be treated for
  LTBI
• Casual contacts (LOW RISK) can have IGRA
  confirmation if TST positive to verify infection
  vs BCG or MOTT
• 5. Immunocompromised
• TST first, if negative do IGRA and if IGRA
  positive treat as LTBI
• 6. Low risk people who are TST positive
• Do an IGRA, if positive consider as LTBI

28
2007 Canadian Guidelines

• IGRAs not recommended for
• 1. Serial testing
• 2. Children
• 3. Immigrant screening
• 7. Diagnosing active TB

29
2007 Canadian Guidelines

• DIAGNOSIS OF ACTIVE TB DISEASE
• IGRA sensitivity in active TB has been found to
  be comparable to the sensitivity of TST (up to
  30 negative). This reflects the diminished
  immune response in patients with active TB
  particularly in those with more advanced disease,
  malnutrition or older age.
• Therefore, IGRAs are NOT recommended for the
  diagnosis of active TB.

30
Screening della popolazione

• NESSUNA strategia è costo efficace se lincidenza
  della LTBI lt 10.
• Con incidenza della LTBI del 10-40, il test
  della tubercolina a 2-step, seguito da un test
  IGRA sui pazienti positivi alla tubercolina, è
  cost-effective.
• Luso del solo IGRA test è costo efficace SOLO SE
  lincidenza della LTBI è 40.

31
Test nei bambini

• A total of 243 children (median age 18 months)
  were recruited,88 had interpretable T-SPOT.TB
  results. Children gt12 months of age were more
  likely than younger children to have positive
  T-SPOT.TB resuts TSTs were unaffected by age.
• CONCLUSIONS. For young children presenting in a
  community setting after exposure to tuberculosis
  or with symptoms suggesting tuberculosis,
  T-SPOT.TB cannot be used to exclude active
  disease. The sensitivity of this assay may be
  impaired for very young children.

32
Test nei bambini
Data for 207 children with valid tuberculin skin
test and QuantiFERON-TB Gold In-Tube test
results excellent correlation between negative
tuberculin skin test results and negative
QuantiFERON-TB Gold In-Tube only 23 of
children with positive tuberculin skin test
results had positive QuantiFERON-TB Gold
In-Tube Positive QuantiFERON-TB Gold In-Tube test
results were associated with increased likelihood
of M tuberculosis exposure. Younger children
produced lower interferon levels Performance
characteristics were similar across all age
groups. CONCLUSION The QuantiFERON-TB Gold
In-Tube test is a speci?c test for M tuberculosis
exposure in children performance characteristics
similar to those for adultsin regions with low
levels of endemic disease. Concerns about test
sensitivity, especially for young children will
require additional prospective long-term
evaluation. Pediatrics 20091233037
33
IGRA e HIV

• Stephan et al AIDS 2008
• Scopo del lavoro valutazione incidenza e fattori
  di rischio in HIV e pragone tra i test
• 286 pazienti in paese a bassa prevalenza
• Entrambi IGRA più sensibili di TST ma meno
  sensibili che in non HIV
• Bassa concordanza tre i test
• Tspot indipendente dalla conta di CD4

34
Alcune questioni fondamentali ancora poco chiare

• Qual è il valore predittivo degli IGRA nello
  sviluppo di una TBC attiva?
• Qual è linterpretazione delle conversioni e
  delle reversioni del test IGRA?
• Qual è la prognosi di una conversione IGRA?
• Possiamo utilizzare i livelli di IFN-gamma per
  diagnosticare la malattia?
• Può un TST boosterare successive risposte IGRA?

35
IGRA Tests PPV?

• Menzies et al. Meta-analysis New test for the
  diagnosis of LTBI areas of uncertainty and
  recommendations for research. Ann Int Med
  2007146340-54
• I nuovi test IGRA si rivelano unimportante
  promessa e posseggono un eccellente specificità.
  Ulteriori studi sono necessari per una più
  accurata valutazione delle performance in
  popolazioni ad alto rischio e nel testing
  seriale. Studi longitudinali sono necessari per
  definire il valore predittivo degli IGRA test.

36
NPV

• Il Valore Predittivo Negativo di un test negativo
  non è ancora stato definito né in setting ad alta
  prevalenza né in quelli a bassa prevalenza

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IGRA e anti TNF alfa

• Raccomandazioni per lo screening della TBC prima
  di una terapia anti-TNF-alfa, in Svizzera
• Swiss Med Wkly 2007 137621-622. (November 3,
  2007) (Official journal of the Swiss ID, GIM and
  Resp. Societies)
• Screening raccomandato utilizzando la storia del
  paziente, e IGRA test invece del TST.
• Indeterminato significa utilizzare solo la
  storia del paziente e la RX torace, con approccio
  conservativo.

38
? Ruolo degli IGRA pre-TNF

• Dati solo da alcune coorti
• Pratt A et al. Rheumatology 2007
• 101 pazienti AR, 99 bianchi
• Età media 55 78.5 BCG vaccinati
• 7 QFT 84 QTF- 11 indeterminati
• 6-30 mesi di FU (media 18.3)
• No TBC (ma..)

39
IGRA Testing pre TNF

• Incidenza TBC, bianchi, 50 anni 5/100.000
• Incidenza LTBI, bianchi, 50 anni 50/100.000
• Perciò veri positivi 1/2.000
• Numero di test IGRA per veri vi 2.000
• QFT (a 35)
  70.000
• T-Spot (a 100)
  200.000

40
IGRA testing pre TNF

• In gruppi ad alto rischio (Asia meridionale
  /neri-Africani, nati allestero)
• Circa 200/100.000 malati
• 2.000/100.000 LTBI
• 50 test per individuare 1 vero positivo
• 1.750 QFT, oppure 5.000 T-spot
• Ma il NPV di un test negativo NON È ANCORA NOTO

41
Effetto della vaccinazione con BCG sul TST

• Analisi di 24 studi con N 240,243 soggetti
• Quando il BCG è somministrato nellinfanzia, 6
  falsi-positivi nei risultati del TST a causa del
  BCG
• Quando il BCG è somministrato dopo linfanzia,
  40 falsi-positivi a causa del BCG

42
Vantaggi degli IGRAs nei test seriali

• I test IGRA offrono alcuni vantaggi nei test
  seriali
• una più alta specificità
• mancanza di effetti dovuti al BCG
• numero inferiore di visite richieste
• non necessita di un protocollo a 2-step
• il boosting non rappresenta un problema

43
Prima che gli IGRA possano essere usati
efficacemente nel test seriale vi sono alcune
domande a cui è necessario rispondere

1. Qual è la riproducibilità della risposta dei
   linfociti T nel tempo
2. Cosè una reversione IGRA e qual è il valore
   soglia per definire una reversione?
3. Cosè una conversione IGRA e qual è il valore
   soglia per definire una conversione?
4. Qual è lassociazione tra una conversione IGRA e
   il rischio di progressione a malattia?
5. Il trattamento dei casi di conversione IGRA
   riduce il rischio di progressione a malattia?

44
Cosa sappiamo della riproducibilità della
risposta dei linfociti T nel tempo?

• I dati sono limitati
• Se ulteriori studi confermeranno queste scoperte
  
• Se i risultati IGRA intorno al cut-off mostrano
  una maggiore oscillazione allora ciò ha
  implicazioni sulla reversione e conversione
• Gli IGRAs sono troppo dinamici da compromettere
  la stabilità nei test seriali?
• Può la natura dinamica spiegare gli alti tassi
  di reversione?
• Il fatto che i casi IGRA-positivi in pratica non
  sono ritestati, può essere rilevante?
• Nella pratica clinica, i casi TST-/IGRA
  dovrebbero essere ritestati?

45
(No Transcript)
46
Riproducibilità del QTBgoldIT
47
Cosa sappiamo della reversione IGRA?

• Le reversioni sono ben documentate
• Le reversioni sono meno probabili quando i
  risultati baseline sono doppi-positivi
  (TST/IGRA)
• Nei doppi-positivi si attende una marcata
  risposta IFN-gamma
• Le reversioni sono più probabili quando i i
  livelli basali sono discordanti (TST-/IGRA)
• I risultati discordanti sono in genere risposte
  deboli
• Bassi livelli di IFN- gamma are sono vicini al
  cut-off
• variazioni non-specifiche intorno al cut-off
  possono portare a reversione
• Quindi, perché le reversioni avvengono?
• Alcune reversioni potrebbero riflettere la
  scomparsa dellinfezione
• Alcune reversioni potrebbero semplicemente essere
  dovute a variazioni biologiche (oscillazione)
  negli IGRA-positivi, e noi selezioniamo pazienti
  che si trovano nella fase di diminuzione della
  risposta allinfezione
• Alcune reversioni potrebbero essere dovute a
  variazioni nelle procedure di laboratorio
  (manipolazione del campione, lavaggio nellELISA,
  etc.)

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Conversioni

• Domande chiave
• Quale aumento nella concentrazione di IFN-gamma è
  biologicamente indicativo di una nuova infezione,
  e quanto è dovuto al solo test o è oscillazione
  biologica?
• Dovremmo usare il cut-off diagnostico anche per
  le conversioni?
• Qual è il miglior modo per stabilire i cut-off?

49
Cosa sappiamo delle conversioni IGRA?

• Le reversioni sono ben documentate
• A seconda del cut-off usato per la conversione, i
  livelli variano molto!
• Se per definire le conversioni si usa un semplice
  cut-off negativo-positivo, allora le conversioni
  saranno maggiori con IGRA che con TST (Pai et al,
  2006 Pai et al, 2009 Corbett et al, 2006)
• Ciò può indicare una maggiore sensibilità per le
  conversioni (non necessariamente per
  diagnosi)
• Ad ogni modo, parte dei maggiori livelli di
  conversioni è probabilmente dovuta a variazioni
  minori non-specifiche introno al cut-off (Pai et
  al, AJRCCM 2006 Pai et al. IJTLD 2009)
• Un cut-off più stringente per la conversione
  potrebbe aiutare ad evitare di interpretare
  variazioni minori come conversioni

50
Associazione tra i livelli di IFN-gamma e il
rischio di progressione a malattia

• Evidenza diretta limitata nelluomo
• La correlazione con la carica batterica e la
  patologia può essere solo dedotta
• Però, è stato suggerito che il forte incremento
  nella risposta linfocitaria T agli antigeni RD1
  potrebbe essere predittivo di TBC attiva
• Questo devessere ancora confermato sebbene siano
  disponibili dati verosimili e supportati da
  alcuni dati indiretti

51
(No Transcript)
52
Effetto Booster del TST su IGRAs

• Il prelievo va effettuato entro tre giorni dal TST

53
Riflessioni conclusive

• NON approvato per la diagnosi o alla gestione di
  casi di malattia attiva
• NON differenzia i casi di malattia da quelli di
  infezione.
• Falsi Neg. nei casi di malattia attiva
• Utilità NON dimostrata nel monitoraggio della
  terapia
• Altri studi su coorti di pazienti sono necessari
  per definire PPV e NPV
• Mancano dati sui bambini inferiori a 2 anni

54
Riflessioni conclusive

• I test basati su linfociti T sono dinamici e
  inclini a conversioni e reversioni
• Dovremo definire una soglia per la conversione,
  basata su dati empirici e studi di
  riproducibilità
• La prognosi delle conversioni e reversioni IGRA
  dovrà essere determinata
• Soggetti con marcato aumento in risposte
  IFN-gamma hanno maggiore probabilità di
  progredire verso la malattia (questo potrebbe non
  essere vero per la riattivazione della TBC)
• Nei soggetti immonodepressi sensibilità maggiore
  rispetto al TST con Tspot meno influenzato dal
  numero di linfociti
• Studi di coorte sono necessari per rispondere a
  questioni fondamentali e fornire dati che aiutino
  a interpretare i risultati degli IGRA test seriali

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• Giustificato economicamente il test a 2 step,
  come indicato nel NICE per lo screening dei
  contatti e generale
• Esclude i falsi positivi dovuti a BCG and MNT
• Economicamente non giustificato luso di pre-TNF
  Rx in popolazioni ad incidenza molto bassa