Diagnostic de linfluenza aviaire hautement pathogne: prlvement, conservation , Techniques de Diagnos

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Diagnostic de linfluenza aviaire hautement
pathogèneprélèvement, conservation , Techniques
de Diagnostic, envoi au Lab de ref

• Par Modou Moustapha Lô
• Virologie/LNERV/ISRA

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Influenza Aviaire

• Influenza Aviaire est une maladie hautement
  contagieuse des oiseaux
• Linfection de lhomme avec virus aviaires (aussi
  H5N1) est un événement rare et facilité par des
  conditions particulières
• Contact direct avec des oiseaux morts ou malades
• Contact direct avec des surfaces ou du matériel
  contaminé par des excrétions et secrétions (p.e.
  fèces)
• Contact des membranes muqueuses (orale, oculaire,
  nasale) avec de laérosol infecté

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Norme de référence sur la sécurité

• Il est necessaire de considérer le risque d
  exposition aux agents biologiques, dans toutes
  les structures de travail
• d organiser des procédures de contrôle
  technique pour le présent et le futur afin d
  éviter l exposition aux agents biologiques
  dangereux
• Aussi les mesures de protection doivent être
  sélectionnées en fonction des caractéristiques
  des agents biologiques et de l activité menée
  dans les structures

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AI/2
Le virus de linfluenza Aviaire est un agent
biologique de classe 2 (classification
OMS) Classe 2 Agent biologique qui peut causer
la maladie chez lhomme, qui constitue un risque
pour les travailleurs, la transmission à la
société nest pas automatique Et que des mesures
préventives ou thérapeutiques soient disponibles
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Mesures préventives individuelles

• Vaccination du staff pour éviter les
  recombinaisons entre virus aviaires et humaines.
• Utilisation de médecines antivirales dépendant
  du risque dexposition.

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MDP

• Masques N95 -FFP2
• Lunettes protectrices EN166
• Viseur de Protection (pendant autopsie pour
  protéger tout le visage) EN 166

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Niveau de sécurité 2

• Présence dune hotte à flux laminaire de classe 2
  pour la protection du personnel vis-à-vis
  déventuels aérosols contenant le virus
• Exposition du signal du risque biologique à
  lextérieur de la structure
• Disponibilité dune autoclave pour linactivation
  des déchets avant leur élimination

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Niveau de sécurité 2

• Il faut que chaque opération (ouverture des
  emballages de prélèvements ou déchantillons,
  inoculation et ouverture des ufs embryonnés,
  caractérisation du virus, etc..) soit faite sous
  une hotte à flux laminaire (sécurité classe 2)
• Hotte de sécurité biologique de classe 2
• Elles sont utilisées lors de la manipulation
  dagents biologiques avec risque dinfection
  moyen. Elles protègent lopérateur, le milieu
  ambiant et léchantillon ainsi qune
  contamination éventuelle de lextérieur de leur
  enceinte. Lair extérieur est aspiré et purifié
  par un filtre HEPA avant dêtre rejeté une
  deuxième fois dans laire de travail sous hotte.

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Normes de comportement

• Eviter les opérations qui pourraient amener en
  contact du matériel infectieux avec les muqueuses
  (P.ex. Se frotter les yeux avec les mains
  contaminées) ou linhalation de poussière de
  fientes sèches.
• Avant de commencer une autopsie dun oiseau dun
  foyer suspect il est important dutiliser de la
  solution antiseptique (p.ex Virkon?) pour
  mouiller les carcasses et les plumes pour réduire
  la poussière.
• Le personnel doit se laver les mains avec eau et
  savon pendant au moins 15-20 secondes après avoir
  enlevés les gants et avant de toucher des
  surfaces ou du matériel non contaminé.

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Situations particulières

• Infections Expérimentales
• Élimination de foyers

• Combinaison Tyvek jetable avec chapeau
• Couvre bottes résistants
• Bottes en plastique
• Gants mono usage
• Lunettes
• Masques ou masques couvrant tout le visage avec
  filtre P3 ou HEPA

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• Prélèvement /1
• Prélèvement sur loiseau vivant
• Cavité orale et pharyngée
• Partie orale de la trachée
• Cavité cloacale
• Attention
• Les résidus des aliments
• La contamination de la trachée avec le sang
• Récolter du matériel fécal en abondance
• Lécouvillon trachéal est léchantillon de choix
  chez les Gallinacés (par exemple poulet et
  dinde)
• Lécouvillon cloacal est le plus indiqué pour les
  Ansériformes (par exemple canard et oie)

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Prélèvement/2

• Prélèvement sur loiseau mort
• Trachée et poumon sont les échantillons de choix
• Aussi le tractus intestinal, de préfèrence les
  amygdales caecales (dans les Gallinacés) et la
  partie distale du colon (dans les Ansériformes)
• Si on suspecte une infection par un virus HP, il
  faudrait collecter aussi le cerveau.
• Les tampons utilisés doivent être en coton et
  tous les outils doivent être stériles.

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Solution Saline Phosphate (PBS)

• NaCl 0,8 (8 gr/1 l deau dé ionisée)
• KH2PO4 0,02 (0,2 gr /1 l deau dé ionisée)
• Na2HPO4 0,29 (2,9 gr/1 l deau dé ionisée)
• KCl 0,02 (0,2 gr/1 l deau dé ionisée)
• Éventuellement ajuster le pH à 7,2-7,4 avec HCl
  (1N) ou NaOH (1N)
• Maintenir la solution à 4C pendant 3 mois

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Solution Saline Phosphate (PBS) et antibiotiques

• Milieu de transport pour les échantillons
  virologiques
• Stériliser la solution de PBS
• Ajouter des antibiotiques
• 10.000 UI/ml Pénicilline
• 10 mg/ml Streptomycine
• 5.000 UI/ml Nystatine
• 250 ug/ml Gentamycine
• Maintenir la solution à 4C pendant 3 mois

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• Conservation et envoi des échantillons/1
• Température de conservation déchantillons
• entre 4 et 8C
• à -80C
• en glace carbonique
• en nitrogène liquide
• Utiliser des boites résistantes aux changement de
  température
• Éviter la verrerie ou tout matériel fragile
• Sceller les récipients pour éviter la fuite et
  marquer les convenablement pour identifier le
  contenu
• Pendant le stockage et le transport, submerger
  les échantillons dans un moyens de transport
  appropriés (conserver la viabilité des virus et
  éviter la croissance bactérienne)

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Conservation et envoi des échantillons/2

• Les échantillons soumis pour isolement du virus
  doivent être transportés dans de la glace
  carbonique
• Les échantillons délivrés au labo pendant 24-36
  hrs peuvent être transportés réfrigérés, on peut
  ainsi éviter l'addition du milieu de transport
• Ne pas dépasser le volume du milieu de transport
  pour éviter une dilution excessive du virus
  présent

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Volumes du milieu de transport
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Envoi des échantillons aux labos de Référence/1

• Emballages nécessaires
• Étanche aux liquides
• Deux récipients
• Une boite extérieure à structure rigide

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Envoi des échantillons aux labos de Référence/1

• Documents nécessaires à lextérieur des boites
• Autorisation à limportation du Pays qui reçoit
• Facture formelle en huit copies signées
• Code correspondant au type de matériel envoyé

Envoyeur
Prière dindiquer un adresse téléphonique du
receveur
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Envoi des échantillons aux labos de Référence/2

• Échantillons diagnostics (Code UN3373)
• Boites conformes au Model IATA PI650
• Souche virale (VIAHP ou VMN) (Codes UN2814 ou
  UN2900)
• Boites conformes au Model IATA PI602

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Les Types de diagnostic

• Anamnèse
• Observation clinique
• Observation des lésions
• Diagnostic de labo
• - Virologie
• -Technique moléculaire (RT-PCR)
• - Immunologique à travers lutilisation
  denzymes (Elisa à lAg)
• - Sérologie (IHA, AGID, ELISA)
• - Histologie

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Inhibition de lHémagglutination/IHA

• Les Anticorps spécifiques montrent une inhibition
  de lhémagglutination du virus

Acs spécifiques à lHémagglutinine
INHIBITION (il ya sédimentation des hématies)

virus

Hémagglutination

Anticorps aspécifiques
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Kits ELISA

• ELISA à lantigène
• ELISA à lanticorps
• Indirect (les Acs secondaires cherchent les Acs
  éventuellement présents dans le sérum à tester)
• Compétitif (le sérum à tester et les Acs sont en
  compétition sur le même Ag)
• Il ny a encore de kits à lAnticorps
  standardisés et recommandés par lOIE

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Kits ELISA à lantigène

• Très sensible
• Standardisé par lOIE
• 20 minutes
• Attention au type déchantillon (écouvillons
  trachéales en pool)

• DIRECTIGEN FLU A (Becton Dickinson Co.) pour
  écouvillons trachéales seulement

positif
négatif
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Objectifs des tests

• AGID detection IgM et IgG dirigés contre le
  virus de la grippe aviaire, aussi detection de l
  antigène à partir d un isolat
• IHA détection des anticorps dirigés contre les
  sous types exple H5, H7 et H9
• ELISA détection IgG
• Directigen Flu A / Flu Detect détection de l
  antigène du virus type A de la grippe aviaire

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Procédure de diagnostic pour échantillons
doiseaux sauvages
SCREENING
Arrivée déchantillon
Enregistrement

RT-PCR à lIA type A ou AGID ou Directigen Flu A
ou Flu Detect
Échantillon positif
Échantillon négatif
Caractérisation auprès dun Labo OFFLU
Isolement Viral en uf embryonnés SPF de 9-11
jours
RT-PCR pour type H5
Échantillon négatif
Échantillon positif

• Séquençage
• (PEIPKGRGLF)
• ou
• (PEIPKGSRVRRGLF)

Caractérisation virale 1) Méthode sérologique
(IHA, INA) 2) RT-PCR (H5 et/ou N1)
Séquençage du nucléotide pour la recherche de
multiples aminoacides basiques au site de
cleavage de lhémagglutinine
IVPI (optionnel) pour H5 et H7 IAHP
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Expériences du LNERV/ISRA/1

• 51 prélèvements autopsiés, alicotés en triple et
  testés au LNERV et résultats négatifs confirmés
  par Padoue
• Une partie est envoyée à IPD
• Tous ces prélèvements ont fait l objet d un
  diagnostic différentiel et 3 cas de NC et 1 cas
  de Gumboro confirmés

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Experiences du LNERV/ISRA/2

• Acquis
• - Formations de 2 techniciens sur les
  méthodes de diagnostics de l Influenza aviaire
  hautement pathogène au NVLS USA
• - Formation en Biosafety et Biosecurity
• At Colorado state University
• - Disponibilité de tous les tests de
  diagnostic serologique, virologique et
  moléculaire