RMN de proteinas

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• RMN de proteinas
• Ahora mas o menos conocemos las tecnicas que se
  utilizan
• en la determinacion de redes de acoples
  (estructura quimica)
• y distancias internucleares (estructura 3D,
  conformacion).
• Vamos a ver como se utilizan en el estudio de
  estructura
• 3D y preferencias conformacionales de
  macromoleculas, en
• particular proteinas. Vamos a tratar de cubrir
  en dos calses
• algo para lo que se han escrito muchos libros
• Hay ciertas cosas que tenemos que mencionar
  antes de
• hacer una analisis de las tecnicas de RMN de
  proteinas
• 1) La informacion que obtenemos no es ni mejor ni
  peor que
• los datos de rayos-X. Nos da una imagen que
  puede ser
• considerada complemetaria a la
  cristalografica. En ciertos
• aspectos experimentales es mas rapido que los
  rayos-X.

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• Breve resumen de estructura de proteinas
• Antes de ver como determinamos la estructura 3D
  de una
• proteina por RMN, vamos a repasar un poco de
  bioquimica
• Las proteinas/peptidos estan armados de 20
  aminoacidos.
• Esto nos va a hacer la vida mas facil
• La estructura quimica de la proteina es la
  secuencia de
• aminoacidos que la forman. Siempre la
  escribimos del NH2
• libre al COOH libre

Ha
residuo
H
O
O
H
N
N
N
N
O
H
H
Ha
Ha
grupo peptidico
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• Estructura de proteinas (continuado)
• La forma en que los residuos de la proteina se
  organizan lo-
• calmente es la estructura secundaria. Los
  elementos mas
• comunes de estructura secundaria son la
  a-helice y la hoja
• plegada b (paralela o antiparalela)

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• Las basicas de la RMN de proteinas
• La estructura terciaria es como todo se acomoda
  (o no) en
• solucion, o como los distintos elementos de
  estructura secun-
• daria se organizan espacialmente entre ellos.
• Lo primero que tenemos que saber es donde
  aparecen los
• picos de los 1Hs de los aminoacidos en el
  espectro
• Como estan muy cerca unos de otros, despues de 3
  o 4

agua
Aromaticos
Iminas Amidas
HCb, g, d, ...
HCa
10 9 8 7 6 5
4 3 2 1 0
5

• Asignacion de sistemas de espines
• Para hacer esto, nos valemos de los espectros 1H
  1D (si es
• un peptido), COSY, y TOCSY. Ya hemos visto como
  un
• TOCSY nos permite identificar todo un sistema
  de espines.
• En proteinas, cada aminoacido nos va a dar una
  linea inde-
• pendiente en el TOCSY empezando en el NH y
  llendo hasta
• el ultimo proton de su cadena lateral.
• Las unicas excepciones son Phe, Tyr, Trp, e His,
  donde
• el sistema de espines de la cadena lateral esta
  dividido en
• dos por un carbono cuaternario.
• Con suerte podemos asignar todas las señales a
  amino-
• acidos, pero lo mas probable es que nos queden
  algunas sin
• asignar porque esten solapadas. Si pasa esto
  necesitamos
• mas dimensiones y/o proteina marcada (mas
  luego).

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• Patrones NOE caracteristicos
• Las mas simples de identificar son correlaciones
  interesi-
• duales y secuenciales, que corresponden con
  NOEs entre
• protones de un residuo a protones de residuos
  (i 1)
• Aparte de estos, regiones de estructura
  secundaria definida
• van a dar NOE caracteristicos. En ?-helices y
  hojas ?

dNN
daa
daN
Ha
H
O
O
H
N
N
N
N
O
H
H
Ha
Ha
dNb, dNg,
daa
dab, dag,
da(i)N(j)
i4
C
N
i3
dab(i, i3) daN(i, i3) dNN(i, i3) daN (i, i4)
i2
da(i)a(j)
N
C
C
N
i1
dN(i)N(j)
i
N
C
i-1
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• Asignacion secuencial
• En el metodo de asignacion secuencial tratamos
  de atar sis-
• temas de espines por medio de conectividades
  NOE secuen-
• ciales (de un residuo a residuos i 1 y/o i -
  1).
• La idea es elejir un residuo cuyas señales esten
  bien resuel-
• tas en el TOCSY y despues buscar en el NOESY
  correlacio-
• nes NOE secuenciales de sus protones a protones
  en otros
• sistemas de espines.
• Estas son generalmente correlaciones dNN, daN,
  and dbN. En
• este momento tambien podemos buscar
  correlaciones dbd
• para establecer la identidad de los residuos
  aromaticos, Asn,
• Arg, Gln, etc
• Despues de encontrar esos, volvemos al TOCSY
  para identi-
• ficar a que residuo corresponden las
  correlaciones que vimos
• en el NOESY. Esos protones van a estar en
  residuos i 1.

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• Asignacion secuencial (continuado)
• Esto lo podemos ver en un diagrama simple (no
  encontre
• nada muy lindo entre lo mio).
• Digamos que estamos miarando cuatro lineas en el
  TOCSY
• que corresponden a Ala, Asn, Gly y Leu. Tambien
  sabemos
• que tenemos Ala-Leu-Gly en el peptido, y no en
  otro orden.

TOCSY NOESY
HC
HC
Gly
Gly
Asn
Asn
Ala
Ala
NH
NH
Leu
Leu
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• Metodo de cadena principal
• Este metodo fue propuesto por Wüthrich (el
  abuelo del RMN
• de proteinas y ganador del Nobel en Quimica del
  2003 por su
• trabajo en el area). Ya hemos visto que
  regiones de estructu-
• ra secundaria definidas dan patrones de NOE
  regulares.
• Qut tal si, en vez de hacer la asignacion
  secuencial y perder
• tiempo en regiones que tengan estructura
  indefinida, nos
• concentramos en buscar estos patrones de NOE
  regulares?
• Esto es exactamente lo que hace este metodo.
  Buscamos
• patrones de NOE ciclicos, que se dan
  generalmente cuando
• tenemos estructura secundaria definida.
• Cuando encontramos estos patrones de NOE,
  tratamos de
• correlacionarlos con fragmentos de la
  estructura primaria de
• la proteina/peptido. Es ideal para hacer por
  computadora

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• Estructura secundaria y terciaria
• A pesar de que el metodo de cadena principal
  encuentra
• patrones de estructura secundaria, el fin es
  identificar los
• residuos en el espectro (i.e., asignar sistemas
  de espines).
• Todavia hay que buscar la estructura
  secundaria/terciaria.
• Si usamos el metodo de cadena principal, ya
  tenemos casi
• todo el trabajo hecho (casi el 90 ), porque
  las regiones de
• estructura secundaria definida (a-helices,
  hojas b) ya las
• tenemos identificados.
• Si usamos el metodo secuencial tenemos casi
  todos los NOE
• entre el residuo i e i 1 y i - 1, o de rango
  corto. Solo nos
• queda buscar correlaciones NOE de rango medio
  (i 2, 3,
• y 4) y de rango largo (gt i 5).
• La cantidad y tipo de NOEs de rango largo
  obviamente de-
• pendera de la estructura secundaria/terciaria
  del peptido.

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• Lo que el NOE nos dice y lo que no nos dice
• Ahora tenemos casi todo Los sistemas de espines
  identifi-
• cados, sus NOEs secuenciales, medios, y largos
  medidos, y
• sus intensidades tabuladas.
• A esta altura vamos a tener algunos conflictos
  en las asig-
• naciones. En particular, hay casos en los
  cuales vamos a ver
• ciertos NOE pero no otros que tendrian que
  estar alli
• Esto es debido a que los NOE no solo dependen de
  la dis-
• tancia entre dos protones, pero tambien de la
  dinamica entre
• ellos (osea, el grado de movimiento de uno con
  respecto al
• otro). Esto va a ser importante en peptidos
  chicos, porque en
• estos casos tenemos mucha movilidad en las
  cadenas late-
• rales y en el esqueleto peptidico.
• Lo mas importante a tener en cuenta siempre es
  que no ver
• un NOE no significa que dos protones esten a
  mas de 5 Å.

Aparente
Real
dij 3 Å
dij lt 3 Å
dij gt 6 Å
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• Acoples y angulos diedros
• Hasta ahora hemos visto como usar algunos datos
  de RMN
• para obtener parametros estructurales usados en
  la determi-
• nacion de estructuras 3D de macromoleculas en
  solucion.
• En particular, los NOE nos permiten determinar
  distancias
• aproximadas entre protones cercanos. Son muy
  utiles si los
• vemos entre protones que estan en residuos que
  esten dis-
• tantes uno de otro en la estructura primaria.
• Sin embargo, los NOE no nos permiten, en
  general, decir na-
• da acerca de la conformacion de enlaces con
  libre rotacion.
• Para determinar esto podemos usar acoples 3J
  que se obser-
• van en peptidos (o azucares, ADN, y ARN). Se
  pueden usar
• acoples 3J/2J homo/heteronucleares, pero nos
  vamos a con-
• centrar en el acople 3J homonuclear.
• Estos incluyen 3JNa, que nos da informacion
  acerca de la

H
O
f
w
N
3JNa f 3Jab c
c
N
y
Hb
Ha
H
Hb
AA
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• Acoples y angulos diedros (continuado)
• Como vimos, la constante de acoplamiento 3J
  esta relacio-
• nada con el angulo diedro por la ecuacion de
  Karplus.
• Como vimos antes, la ecuacion es una suma de
  cosenos, y
• dependiendo de la topologia (H-N-C-H or
  H-C-C-H) tenemos
• distintos parametros
• Los parametros han sido derivados de moleculas
  rigidas y
• datos de rayos-X. Graficamente

3JNa 9.4 cos2( f - 60 ) - 1.1 cos( f - 60 )
0.4 3Jab 9.5 cos2( y - 60 ) - 1.6 cos( y - 60
) 1.8
3J (Hz)
f - 60
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• Acoples y angulos diedros ()
• Como medimos las 3J? Si tenemos pocos
  aminoacidos,
• directamente del 1D. Tambien las podemos medir
  de espe-
• ctros HOMO2DJ, o de espectros tipo COSY de alta
  resolu-
• cion (MQF-COSY y E-COSY).
• El problema mas grande de la ecuacion de Karplus
  es que
• introduce ambiguedades. Si tenemos acoples 3JNa
  menores
• de 4 Hz y los pongo en la grafica vemos que
  podemos tener
• hasta 4 valores posibles para el angulo f

9.4
5.0
-60
0
110
170
4.0
0.0
f - 60
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• Acoples y angulos diedros ()
• Otra cosa que se puede hacer es usar solo los
  angulos que
• son mas comunes que conocemos de estructuras de
• rayos-X. Para f, los angulos estandar tienen
  valores ne-
• gativos de -60 y -170). Usando rangos
• Para las cadenas laterales tenemos also similar,
  pero en este
• caso hay que elegir entre tres posibles
  rotameros (como en
• etano). Como se pueden medir dos acoples 3Jab
  (hay 2
• protones b), nos permiten elegir el conformero
  adecuado

3JNa lt 5 Hz -80 lt f lt -40 3JNa gt 8 Hz
-150 lt f lt 170 (-190)
N
N
N
Hb1
Hb2
Hb2
Cg
Cg
Hb1
C
C
Ha
Ha
C
Ha
Hb1
Cg
Hb2
3Jab1 3Jab2 lt 5
3Jab1 lt 5 (o vice versa) 3Jab2 gt 8
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• Introduccion al modelado molecular
• Ahora tenemos casi toda la informacion
  estructural que pode-
• mos sacar por RMN de nuestra muestra tablas de
  NOEs con
• distintas intensidades (distancias), constantes
  de acople 3J, y
• rangos de angulos derivados de los acoples 3J.
• Tenemos que ver como usar toda esta informacion
  para ob-
• tener una imagen de la molecula en solucion.
• Contrario a los rayos-X, con los que vemos la
  densidad
• electronica de la molecula y pueden ser
  considerados como
• un metodo directo, con RMN solo obtenemos
  informacion in-
• directa acerca de la estructura, y esta
  informacion la dan
• unos pocos atomos (basicamente los 1Hs).
• Por lo tanto nos valemos de un modelo teorico
  para repre-
• sentar a la macromolecula. En general, esto es
  un modelo
• molecular generado por computadora.

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• Modelado molecular (continuado)
• Aca estamos lidiando con proteinas (miles de
  atomos), osea
• que usamos mecanica molecular (MM).
• El corazon de la MM es el campo de fuerza (force
  field) o
• las ecuaciones que describen la energia del
  sistema en fun-
• cion de las coordenadas xyz. En general es una
  suma de
• distintos terminos de energia
• Cada termino depende de una forma u otra con la
  geometria
• del sistema. Por ejemplo, Een, o potencial de
  enlace del sis-
• tema (bond stretching), es

Etotal EvdW Een Ean Etor Eelec
Een Si Keni ( ri - roi )2
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• Incorporacion de datos de RMN
• Lo bueno de los campos de fuerza para MM es que
  si tene-
• mos una funcion que relacione nuestros datos
  experimenta-
• les con las coordenadas xyz la podemos sumar
  directamen-
• te a la ecuacion del potencial total del
  sistema.
• Esto es lo que hacemos con los datos derivados
  de RMN.
• Para NOEs usamos rangos de distancias en vez de
  valores
• unicos porque podemos tener otros fenomenos de
  relajacion
• en juego, y/o promediado de NOEs
• La funcion de energia potencial relacionada con
  estos rangos

NOE fuerte 1.8 - 2.7 Å NOE medio 1.8 - 3.3 Å NOE
debil 1.8 - 5.0 Å
ENOE KNOE ( rcalc - rmax )2 si
rcalc gt rmax ENOE 0 si rmax
gt rcalc gt rmin ENOE KNOE ( rmin - rcalc )2
si rcalc lt rmin
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• Incorporacion de datos de RMN (continuado)
• De manera similar podemos incluir restricciones
  en el rango
• de angulos o constantes de acoplamiento
• Graficamente, las funciones tienen este aspecto

EJ KJ ( Jcalc - Jmax )2 si Jcalc gt
Jmax EJ 0 si Jmax gt Jcalc gt Jmin EJ
KJ (Jcalc - Jmin )2 si Jcalc lt Jmin
E 0
rmax fmax Jmax
rmin fmin Jmin
Rcalc, fcalc, o Jcalc
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• Optimizacion de estructuras
• Ahora tenemos todas las funciones incluidas en
  el potencial
• de la molecula, incluyendo interacciones
  covalentes (enlace,
• angulos, y torsiones), no covalentes (vdW,
  electroestatica), y
• restricciones NOE y 3J derivadas de RMN.
• Para obtener un modelo estructural del peptido
  decente hay
• que minimizar la energia del sistema, lo que
  implica encon-
• trar un conforermo de baja energia (o el de mas
  baja energia)
• o una familia de conformeros de baja energia.
• En una funcion con la cantidad de variables que
  tenemos
• en un peptido esto es laborioso, porque tenemos
  una super-
• ficie de n dimensiones (cada uno de las
  variables que esta-
• mos optimizando). Para ? y ? en un disacarido

E (Kcal/mol)
y
f
21

• Optimizacion de estructuras (continuado)
• Minimizar la funcion implica bajar en la
  (hiper)superficie
• de energia de la molecula. Para esto neceitamos
  calcular
• las derivadas CRA xyz (las variables) de todos
  los atomos
• Esto nos permite ver como vamos para abajo
  para todas
• las variables, y por lo tanto determinar que
  direccion hay
• que tomar para minimizar la energia del
  sistema.
• La minimizacion solo baja. Podemos tener
  muchos minimos
• locales en la superficie, y si solo usamos
  minimizaciones el
• sistema puede quedar atrapado en uno de estos.
  Esto es lo

?Etotal ?Etotal gt 0 Etotal lt 0
Etotal ?xyz ?xyz
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• Dinamica molecular y enfriamineto simulado
• En las DMs calentamos el sistema a una
  temperatura fisica-
• mente razonable, 300 K. La energia por mol
  a esta tempe-
• ratura es RT, donde R es la constante de
  Boltzmann (por
• mol). Si hacemos los numeros, esto es 0.5
  Kcal/mol.
• Esto puede ser suficiente para ciertas barreras,
  pero no para
• otras que seguramente vamos a tener en el
  sistema. Para
• estos casos necesitamos un metodo de busqueda
  conforma-
• cional mas drastico, como ser el templado
  simulado.
• Calentamos el sistema a temperaturas
  ridiculamente altas
• (2000 K), y despues lo dejamos enfriar
  lentamente. La idea
• es que este proceso permite que el sistema pase
  por barre-
• ras energeticas considerables, y al enfriarse
  produzca con-
• formeros estables y de baja energia.

Conformeros calientes Conformeros frios
T
Tiempo (generalmente ps)
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• Geometria de distancia
• Otro metodo compleatmente diferente a la DM y al
  TS es la
• geometria de distancias. Vamos a presentar solo
  lo que
• nos da pero no como funciona.
• Basicamente, randomizamos las coordenadas xyz de
  los
• atomos del peptido dandoles limites altos y
  bajos por fuera
• de los cuales los atomos no pueden estar. Aca
  incluimos los
• enlaces y las restricciones de RMN.
• Esto nos da una matriz de distancias limite, que
  es optimi-
• zada por medio de un algoritmo SIMPLEX
  (desigualdades de
• trinagulos), lo que se conoce como suavizado de
  la matriz.
• Las estructuras que salen de esto no estan
  optimizadas, y
• generalmente las mejoramos por DM y/o
  minimizacion.
• Este esquema da un resumen de como los distintos
  metodos
• hacen que la estructura se mueva en la
  superficie de energia

ME
DM TS
GD
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• Presentacion de resultados
• La idea es samplear el espacio conformacional al
  que la
• proteina tiene acceso bajo los efectos de las
  restricciones
• estructurales que obtuvimos de los NOE y los
  acoples.
• Las estructuras que obtenemos por estos metodos
  que no
• muestren violaciones grandes de las
  restricciones que inclu-
• imos se dicen ser consistentes con los datos de
  RMN.
• Como ninguna de estas estructuras se puede
  descartar, lo
• que hacemos es presentarlas como un set de
  estructuras de
• baja energia superimpuestas en las regiones mas
  rigidas

N-termini
C-termini