- MICROSCOPIA Y TECNICAS DE ESTUDIO CELULAR

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- MICROSCOPIA Y TECNICAS DE ESTUDIO CELULAR
INTRODUCCION A LA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR
http//swehsc.pharmacy.arizona.edu/exppath/micro/l
ightmicro.html http//www.leica-microsystems.com/s
cience-lab/
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Características de un Microscopio
Resolución
Magnificación
Aumento que logra el equipo en esas condiciones
Distancia mínima a la cual el equipo puede
mostrar dos puntos separados
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Microscopio Componentes
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Microscopio Objetivos y concepto de Resolución
Tres características críticas en el diseño de los
objetivos determina el límite de resolución en un
microscopio 1- longitud de onda (l) aquella
usada para iluminar la muestra 2- apertura
angular (m) del cono de luz capturado por el
objetivo 3- índice de refracción (n) del medio
que se encuentra entre el objetivo y la muestra.
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Resolución Apertura numérica (NA)
Apertura numérica (NA) medida de la habilidad
del objetivo de colectar luz y de resolver
detalles finos de la muestra a una distancia
fijada. Y esta determinada por Apertura
angular(m) las ondas generadas cuando la luz
atraviesa la muestra entran en el objetivo en un
cono invertido, el corte longitudinal de este
cono determinan este parámetro. Que a su vez esta
determinado por la longitud focal del
objetivo Indice de refracción (n) del medio que
se encuentra entre el frente de la lente y el
cubre objeto.
NA n sen (m)
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Resolución Indice de refracción (n)
(a) Interfase de aire Los rayos que atraviesan
la muestra son refractados y solamente los
dos rayos mas cercanos al eje óptico tiene el
ángulo apropiado para entrar por la lente del
objetivo.
(b) Interfase de aceite en este caso el aire
se reemplaza colocando aceite de inmersión
cuyo índice de refracción es el mismo que el del
vidrio y los rayos pasan a través de esta
interfase son ninguna desviación debido a la
refracción
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Resolución Longitud de onda (?)
El espectro de luz blanca esta constituido por
distintas longitudes de onda, aquellas que
poseen menor longitud son aquellas que se
dispersan mas o sea que varían mas su ángulo
luego de incidir sobre la muestra.
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Microscopio Formación de la imagen y el efecto
de la interferencia
Alguno de estos rayos desviados se encuentran
180º desfasados con respecto a los rayos que no
han sido modificados, causando una interferencia
destructiva y que conlleva a una reducción en la
intensidad y genera áreas más o menos oscuras.
Este patrón de luces y sombras son las que
finalmente generan la imagen de la muestra.
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Microscopio El problema del contraste
El contraste producido por una muestra es una
medida de distintos fenómenos entre ellos


la luz absorbida


brillo

refractancia


difracción


fluorescencia

rayos desviados


o variaciones en el color
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Microscopio de campo oscuro
El microscopio de campo oscuro es una técnica de
iluminación especializada que capitaliza un
direccionamiento oblicuo de la misma para
aumentar el contraste. En el condensador se
coloca un stop opaco de tal manera que los rayos
lumínicos que pasan a través de la muestra a
partir del ángulo oblicuo son difractados,
refractados y reflejados hacia el objetivo
generando una imagen brillante sobre un fondo
oscuro.
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Microscopio de contraste de fase
Objetos en fase son aquellos que son incapaces de
absorber luz, alterando levemente la fase de la
luz en ¼ de onda con respecto a la luz de orden 0
y esto es imperceptible para el ojo.
Esta técnica emplea un mecanismo óptico que
traslada estas pequeñas diferencias en la fase de
una onda en su correspondiente cambio en la
amplitud, pudiéndose visualizar como diferencias
en el contraste de la imagen.
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Microscopio de contraste de interferencia
diferencial (DIC) o Nomarsky
http//www.leica-microsystems.com/science-lab/diff
erential-interference-contrast-step-by-step-guide-
to-optimal-dic-setup/
Básicamente es un microscopio de luz polarizada
al que se le adicionan 2 prismas, uno por debajo
del condensador y el otro por detrás del
objetivo. Aumentando la resolución y evitando la
generación de artefactos.
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Microscopio de Fluorescencia Conceptos básicos
de fluorescencia
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Inmunofluorescencia
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Microscopio Confocal No irse de plano.
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Microscopios electrónicos de Barrido y
Transmisión
Permiten una capacidad de aumento de hasta 500000
x en comparación de los microscopios ópticos que
solo consiguen una magnificación de 1000x, dado
que el l de los electrones es mucho menor que la
de fotones.
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Microscopía electrónica. Ventajas y desventajas

• Ventajas
• proporciona resultados de amplia resolución y
  magnificación que permiten
• visualizar muestras muy pequeñas.
• Desventajas
• elevados costos de los equipos  y una
  infraestructura adecuada y esto impide el uso de
  esta técnica en cualquier laboratorio.
• altos costos de procesamiento de las muestras
• la manipulación de reactivos se  torna
  peligroso por la elevada condición toxica de los
  mismos.
• procesamiento tedioso de la muestra. Creación
  de artefactos
• la complejidad de los equipos requiere de
  personal técnico especializado.

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Comparación entre imágenes de distintos
microscopios
Microscopio electrónico de barrido
Microscopio electrónico de transmisión
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Otras técnicas.Fluorescent IN SITU
Hibridization (FISH)
Es una técnica relativamente nueva donde se usan
sondas de ADN marcadas fluorescentemente para
detectar o confirmar anormalidades cromosómicas o
génicas, las muestras de ADN (ya sea núcleos
interfásicos o los cromosomas metafásicos) son
desnaturalizadas para separar ambas cadenas, se
agrega luego la sonda de interés y se procede a
la hibridización. La señal de la sonda puede ser
detectada mediante microscopía de fluorescencia.
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Citometría de Flujo
Las células pueden estar vivas o fijadas pero
deben estar dispersas, ya que deben pasar en
fila india a través del rayo láser en un flujo
continuo de la suspensión. Cada célula dispersa
parte de la luz del láser y a su vez emite
fluorescencia si estas células han sido marcadas.
La luz emitida es captada por los
fotomultiplicadores (PMT) que captan una
determinada longitud de. onda y amplifican su
señal. Esto me permite evaluar distintos
parámetros a la vez 1- dispersión
lateral debido al diametro celular 2-
dispersión ortogonal proporcional a la estructura
granular de la célula 3-
fluorescencia por marcaje con fluorocromos.
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Citometría de flujo y cell sorting
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Protocolos
Técnicas histológicas Sirven en conjunto para
facilitar el estudio de las muestras de tejidos.

• Espesor de la muestra

• Técnicas de fijación permite que el tejido a
  analizar no pierda su conformación durante
• la manipulación y cuando es sometido al corte.
  Permitiendo mantener la morfología y la
• composición química de la célula con la menor
  cantidad de artefactos. Además cuanto mayor
• sea la firmeza de la muestra se podrán realizar
  cortes más delgados.
• Medios físicos en general se utiliza calor
  o frío extremo (-160 a -190ºC) seguida de
  deshidratación al vacío a -30/-40ºC
• Medios químicos por ejemplo formol,
  formaldehído, glutaraldehído, metanol o ácido
• acético dependiendo del tipo de macromolécula que
  se quiera analizar. En general estos
• compuestos llevan a la deshidratación del tejido
  y llevan la formación de fuertes uniones
• entre las moléculas.
• Desventajas en general se generan artefactos
  producto de la deshidratación de la muestra
• en el caso del tratamiento en frío se compensa
  esto.

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• Espesor de la muestra AUMENTANDO LA FIRMEZA.

1- Congelación 2- Inclusión en parafina si bien
este tratamiento aumenta la consistencia del
tejido y permite obtener secciones de menor
espesor (1-50 mm) y mayor calidad. Es una
sustancia hidrofóbica por lo que primero el
tejido debe ser deshidratado.
Cómo se realizan los cortes? Micrótomos son
instrumentos que permiten la obtención de estos
cortes ultrafinos hay de distinto tipo por
ejemplo de congelamiento o ultramicrótomo
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• Contraste de la muestra y los problemas
  asociados

Las características de las muestran hacen que
tengan un índice de refracción similar a la luz
de orden 0 por lo tanto la muestran se suelen
colorear o teñir. En general estos colorantes son
compuestos orgánicos y aromáticos son capaces
de explotar las propiedades que poseen algunos
componentes celulares de ionizarse como bases o
ácidos. Colorantes ácidos tienen la capacidad
de unirse a moléculas que presentan carga ,
algunos ejemplos son ácido pícrico, eosina,
naranja G y azul de anilina. Colorantes básicos
tienen la capacidad de unirse a moléculas que
presentan carga -, algunos ejemplos son azul de
metileno, hematoxilina, cristal violeta,
safranina.
Dado que la mayoría de los colorantes son
solubles en agua las muestras deben re-hidratarse
antes de su tinción
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Microscopía Un poquito de óptica
Difracción En física, la difracción es un
fenómeno característico de las ondas que consiste
en la dispersión y curvado aparente de las ondas
cuando encuentran un obstáculo.
Reflexión y Refracción La reflexión es el cambio
abrupto en la dirección de la onda cuando ésta
llega a la unión de dos medios diferentes,
regresando al medio original. Por otro lado, la
refracción es el cambio en velocidad de una onda
cuando pasa de un medio a otro. A menudo el
cambio en velocidad implica un cambio de
dirección.
Dispersión de la luz El grado con el que una onda
se refracta al cambiar de medio depende de las
características propias de la onda. En el caso de
la luz, no se refracta igual la luz azul que la
luz roja. Así, cuando varias ondas viajan juntas
y cambian de medio, las distintas ondas que la
forman pueden separarse, un ejemplo es un prisma.
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Cómo funcionan las lentes de un microscopio?
La luz de un objeto muy lejano a la lente entran
en foco en un punto por detrás de la lente
punto focal localizado en el plano focal. La
imagen virtual que se obtiene es menor que la del
objeto real.
Si ahora acercamos el objeto, vemos que si bien
la distancia focal no varia mientras que la
imagen virtual aumenta.
Si acercamos nuestro objeto hasta alcanzar una
distancia que es 2 veces la distancia focal
obtenemos una imagen virtual del mismo tamaño que
el objeto real pero invertido
Finalmente si el objeto es colocado justo por
delante de la lente el objeto virtual es de mayor
tamaño que el real, obteniéndose una
MAGNIFICACION del objeto.