Sn

1
Národní fytosanitární workshop Soucasné
fytosanitární úkoly a smerování výzkumu v CR z
pohledu výzkumných i ostatních institucí v
kontextu s rozvojem spolupráce v EU dne 3. 3.
2009
Soucasný výzkum viru a viroidu bramboru
Ing. Petr Dedic,CSc. Výzkumný ústav bramborárský
Havlíckuv Brod, s.r.o.
2
Výzkumné projekty NAZV "Bezvirové brambory
eradikace viru S ve šlechtení a množení"
(1997 - 2000) "Bezvirové šlechtení bramboru"
(2001 - 2004) se zabývaly predevším
problematikou udržovacího šlechtení a programy
aktivního ozdravování. Výsledky byly podkladem
pro zarazení PVS do oficiálních kritérií kontroly
zdravotního stavu základních stupnu sadby v
poskliznových zkouškách u nás. Významný vliv na
stupen reinfekcí PVS mely predevším prítomnost
infikovaných rostlin v i mimo sledovaný porost,
stupen rezistence odrud a pocet roku expozice
materiálu v polních podmínkách. Explantátové
kultury a zkrácený cyklus udržovacího šlechtení a
množení prineslo výrazné pozitivní výsledky.
Výhody techto postupu nebyly plne využity na
úseku šlechtení nových odrud kde do registracních
zkoušek byli prihlašováni kríženci se 100
infekce PVS a vlastní ozdravovací proces byl
zahajován vetšinou až po, nebo tesne pred
povolením odrudy.
3

• Navazující projekt 1B53036 Novošlechtení bramboru
  na bezvirovém základe
• Doba rešení 2005 2008,
• byl proto zameren výlucne na materiály
  novošlechtení a zahrnoval prakticky celý rozsah
  šlechtení nových odrud bramboru v CR.
• V rámci navrhovaných aktivit rešení projektu byly
  sledovány rozhodující faktory získání a uchování
  bezvirových materiálu jako je
• úroven rezistence krížencu k PVS (ale též k
  nekterým dalším devastujícím kmenum viru, napr.
  PVY-N),
• komplexní systém laboratorní diagnózy viru ze
  skleníkových a polních výsadeb,
• efektivní prevody casných generací krížencu do
  kultury in vitro a jejich aktivní ozdravování v
  podmínkách in vitro.
• aplikace metod molekulární analýzy, jako podklad
  pro jednoznacnou identifikaci nových gentypu
• Návrat perspektivních krížencu do zkráceného
  systému množení byl smerován k zajištení
  bezvirové hlízové produkce pro registracní
  zkoušky (RZ).

4
Soubežne s rešením problematiky viru S bramboru
probíhal výzkum viru Y bramboru v techto
projektech
Grantová agentura Ceské republiky 2000 -
2002 Název projektu Molekulární variabilita
izolátu viru Y bramboru (PVY) Registracní císlo
projektu 522/00/227 Rešitelská pracovište
Výzkumný ústav bramborárský Havlíckuv Brod,
s.r.o.
Ústav molekulární biologie rostlin AV CR Ceské
Budejovice Na tomto úseku probíhala rovnež
mezinárodní spolupráce s Francií v rámci
projektu BARRANDE
a následne byl rešen projekt NAZV QC 1167
Identifikace, diferenciace a charakterizace
puvodcu nekróz bramboru
virové etiologie Rešitelská pracovište VÚB
Havlíckuv Brod
ÚMBR AV CR C. Budejovice ÚEB AV CR
Praha Doba rešení 2001 2004 Cíl rešení
Vypracování spolehlivé laboratorní diagnostické a
diferenciacní metody pro viry bramboru prenosné
v pude a nekrogenní izoláty viru Y bramboru
(PVY-NTN), vcetne overení citlivosti a vnímavosti
odrud bramboru k infekci a její vliv na
kvalitativní parametry.
5
PMTV TRV
PVY-NTN cv. Hermes Nadine Nicola
Kobra
6
Nejvetší pozornost byla venována kmenové
diferenciaci PVY, které se staly nejzávažnejším
virózou bramboru.
7
Príznaky infekce PVY na rostlinách tabáku N.
tabacum cv. Samsun
PVY-N
PVY-O
8
Organizace génomu PVY-NTN
PVYN or PVYN- related profiles
PVYO or PVYO - related profiles
9
Organizace génomu PVY-Wilga
PVYN or PVYN- related profiles
PVYO or PVYO- related profiles
10
QF 3109 Diferenciace viru S bramboru (PVS) a
identifikace karanténne významných
izolátu technikami molekulární diagnózy
Plánovaná doba rešení 2003 2007 Rešitelé
VÚB Havlíckuv Brod ÚMBR AV CR
Ceské Budejovice Cíl rešení Detailne
charakterizovat kmenové spektrum viru S bramboru
pomocí biologických, sérologických a nove
vyvinutých, overených molekulárních metod a
postupu. Predat optimalizované
diferenciacní postupy státní správe k realizaci
na úseku fytokarantény. Príklady
aktivit A01/06 Detekce viru S bramboru (PVS)
v materiálech génové banky, tuzemských
šlechtitelských materiálech a
 importované sadbe A02/06 Sekvenování fragmentu
molekulárního bypassu izolátu PVS-CS a jejich
porovnání s genomy PVS-O A03/06
Rozpracování metody molekulární hybridizace pro
detekci viru S bramboru A04/06 Diferenciace
izolátu PVS na indikátorových rostlinách a
molekulárními technikami zamerenými
na vybrané oblasti génomu A05/06 Charakterizace
biologických vlastností vybraných izolátu PVS ze
skupiny O a CS A06/06 Biolostická infekce
smesnými vzorky PVS-CS a PVS-O a vytipování
možných rekombinantních klonu.
11
Výsledky uznávacího rízení sadby v CR 2000 - 2008

• Celkem Zkoušeno Uznáno
  Sestupneno Neuznáno
• CR ha
• 2000 5673 92,4 1,0 6,6
• 2001 5178 95,1 0,7 4,2
• 2002 5158 78,0 3,2 18,8
• 2003 4689 87,8 2,3 9,9
• 2004 4933 89,4 3,6 7,0
• 2005 4424 88,3 3,2 8,5
• 2006 3613 73,8 3,0 23,1
• 3831 71,0 5,9 23,2
• 2008 3931 74,9 5,0 20,3

Dle údaju ÚKZÚZ
12
Výskyt viru bramboru ve vzorcích sadby v
poskliznových zkouškách (ks pozitivních reakcí
ELISA)

• Rok V i r u s
• PLRV PVY PVA PVX/PVM (PVS)
• --------------------------------------------------
  ------------------------------------
• 2006
• 1.148 16.055 25 296
  4.466
• 2007
• 3.232 15.257 64 254
  5.518
• --------------------------------------------------
  ------------------------------------
• 2006 L/Y 7,2
• 2007 L/Y 21,2

Podkladové materiály ÚKZÚZ
13
QH 71123 Variabilita viru svinutky bramboru
(PLRV), zvýšení spolehlivosti jeho detekce a
uplatnení transgenóze v rezistentním šlechtení
Plánovaná doba rešení 1.5. 2007 30.12.2011
Cíl rešení Overení biologické a molekulární
variability izolátu PLRV, zvýšení spolehlivosti
jeho laboratorní detekce, identifikace a
diferenciace. Studium možností uplatnení
transgenóze v rezistentním šlechtení bramboru.
Aktivity - Doplnení kolekce izolátu PLRV a
jejich charakterizace  - Biologické vlastnosti
izolátu PLRV- Varianty imunologické diagnózy,
spolehlivost detekce - Varianty molekulární
diagnózy (RT-PCR) a spolehlivost detekce PLRV -
Sekvence vybraných úseku genomu PLRV, návrh
hybridizacních sond- Príprava binárního vektoru
pro transformaci rostlin a transformace
vybraných genotypu bramboru.
14
Detekce izolátu PLRV pomocí RT-PCR (primery dle
Solman et al., 2002)

• ref 1 2 3 4 5 6 7 8 9
  10 11 12 13 14 15 16 17 Z1 18 19 20 21 22
  23 24 25 26 27
• ref hmotnostní standard
• Z1 negativní kontrola
• Izoláty PLRV (1/001 1/1/045)

15
Pokrytí genomu PLRV sekvenováním
23
1
2
6
3
7
9
10
11
14
16
17
21
25
27
28
29
32
8
4
0
2
5
1
3
6
7
53
1000
2000
3000
4000
5000
5900
5R
4R
8R
20R
12R
13R
18R
22R
26R
19R
24R
15R
16
Návrh binárního vektoru pro transformace bramboru
17
od roku 2008 se dále podílíme na rešení projektu
NAZV QH81262 Riziko zdroju karanténního viroidu
PSTVd pro produkcní kultury Solanaceae (brambory
a rajcata) v souvislosti s jeho zjištením v
okrasných rostlinách Rešitelské pracovište
Výzkumný ústav Silva Taroucy pro krajinu a
okrasné zahradnictví, v.v.i. Pruhonice a Výzkumný
ústav bramborárský Havlíckuv Brod,
s.r.o. Plánovaná doba rešení 2008 2011 Cíl
rešení Zjistit a vyhodnotit nove vzniklá
rizika karanténního viroidu PSTVd pro produkcní
kultury Solanaceae (brambory a rajcata) v
souvislosti s jeho zjištením v okrasných
rostlinách v CR.

18
V rámci projektu Výzkumné centrum
1M06030 (MŠMT) Funkcní genomika a proteomika ve
šlechtení rostlin Doba rešení 2006-2009 rešíme
spolu s ÚEB AV CR v.v.i. Praha výstup
V006 Diagnostika virových onemocnení -
pripravit polyklonální protilátky vuci vybraným
rekombinantním antigenum kódovaným genomy
virových patogenu brambor a testovat jejich
využití v diagnostice odpovídajících virových
onemocnení DC6681 Výber vhodných postupu a
syntéza protilátek proti rekombinantním antigenum
rostlinných viru. DC6791 Overení úcinnosti
protilátek proti rekombinantním antigenum viru
bramboru.
Participujeme dále na výzkumném projektu Akademie
ved CR 1QS500510558 Studium výskytu
fytopatogenu a jejich genetických variant Doba
rešení 2005-2009 Rešitelské pracovište
Biologické centrum AV CR, v.v.i. Ceské Budejovice
19
Výzkumný zámer VÚB MSM 6010980701Molekulární a
technologické základy produkce kvalitních brambor

• MŠMT (2004-2010)
• Etapa 01 Vývoj, overení a uplatnení
  molekulárních metod detekce a kvantifikace
  vybraných patogenu a genetických struktur u
  brambor
• (q RT-PCR, detekce viru a viroidu (PSTVd),
  detekce GMO,diagnostické cipy)

20
NÁVRH PROJEKTU DO VEREJNÉ SOUTEŽE VE VÝZKUMU A
VÝVOJI Programu výzkumu v agrárním sektoru
2007-2012 s pocátkem rešení projektu v roce 2009
na roky 2009 - 2011poskytovatel - MINISTERSTVO
ZEMEDELSTVÍ Evidecní císlo projektu - pridelí
NAZV
Podací císlo projektu Vir2 Název
projektuStudium výskytu kmenových skupin a
variant viru Y bramboru (PVY) v sadbe bramboru v
CR VEREJNÁ SOUTEŽProgramu výzkumu v agrárním
sektoru 2007-2012 s pocátkem rešení projektu v
roce 2009 na roky 2009 - 2011 PODPROGRAMEFEKTIVN
Í POSTUPY V AGRÁRNÍM SEKTORUVýzkumný
smerOchrana zdraví rostlin a zvírat Cíl
projektu Stanovit frekvenci výskytu kmenu a
variant PVY ve šlechtitelských a množitelských
materiálech sadby brambor v CR. Charakterizovat
zkoušené odrudy z hlediska vnímavosti a
citlivosti k závažným izolátum nekrotického
charakteru. Doba rešení1.1.2009 - 31.12.2011

1.Oponent - 'ANO' 2. Oponent - 'ANO' 2.
PROGRAMOVÁ KOMISE 'NE' 3. Mze NE - projekt
nebude financován Smlouva nebude uzavrena.
Výsledek prijímacího rízení NEPRIJATO
21
Identifikace zdroju virové infekce a jejich
eliminace ve šlechtitelských materiálech a sadbe
bramboru v CR VS8MZEVAK0913 - Programu Výzkum v
agrárním komplexu, VAK s pocátkem rešení projektu
v roce 2009 PODPROGRAM UDRŽITELNÝ ROZVOJ
AGRÁRNÍHO SEKTORU Zlepšit biologický potenciál
kulturních organismu a zpusoby jeho využívání pro
efektivní produkci potravin.
CÍL PROJEKTU Detekce zdroju virové infekce ve
šlechtitelských a sadbových materiálech,
charakterizace kmenového spektra PVY a reakce
odrud na infekci novými izoláty, overení úcinných
zpusobu ozdravení a zvýšení efektivity
rezistentního šlechtení pomocí DNA
markeru.  Datum zahájení rešení1.6.2009  Výsledky
projektu Exaktní identifikace zdroju virové
infekce v porostech výchozích šlechtitelských
materiálu, základní a certifikované
sadbe,charakterizace izolátu viru Y bramboru na
úrovni kmene resp. varianty, ozdravení
infikovaných materiálu pro potreby bezvirového
šlechtení a aplikace MAS pro efektivní výber nšl.
s vyšší úrovní rezistence proti nejzávažnejším
patogenum, zejména PVY. 
22
Výsledek

• Projekt nesplnil podmínku podle clánku 9 Rámce
  Spolecenství pro státní podporu výzkumu, vývoje a
  inovací (zvláštní pravidla pro zemedelství a
  rybolov) projekt využívá výjimku pro
  zemedelství (uchazec VÚB jako strední podnik
  využívá vyjímku s 90 dotace, pritom strední
  podnik muže mít maximálne 75 dotace vc. bonusu),
  avšak žádný uchazec nedodal cestné prohlášení o
  splnení 4 podmínek k výjimce pro zemedelství
  podle Rámce). Dále upozornujeme, že v návrhu
  projektu chybí výstup na rok 2011.

23
VIROBANKA shromaždování a udržování izolátu
viru in vitro

• Využití
• -Bezprostrední
• zahájení rešení
• výzkumných
• projektu.
• Pr.
• Kryoterapie
• kontrolní izoláty
• mezinárodní
• výmena

Národní program konzervace a využívání genofondu
mikroorganismu a drobných organismu
hospodárského významu. (Dotacní titul) Kolekce
izolátu PLRV-55, PVY-119, PVA-22, PVM-36,
PVX-27, PVS-280 Dále PSTVd, PMTV, TRV, PVV,
PAMV, PRDV. Evidence na internetu.