What on Earth did scientist do before Chromatography?

1
What on Earth did scientist do before
Chromatography?

• Extraction
• is based on the difference in solubility
  material
• is grounded, placed with a solvent which
• dissolves soluble compounds. A second
• extract solvent . The mixture is placed in
  a
• separatory funnel
• Crystallization
• also based on the difference of
  solubility. The
• solubility is solved in a fixed volume of
  solvent.
• The purified compound crystallizes as
  solution
• cools, evaporates or diffuses
• Distillilation
• separates components based on their
  volatility
• typically via vaporization-condensation
• method
• Filtration
• separate components of a mixture based on
  
• their particle size. Used most often to
• separate a liquid from a solid

www.chemguide.co.uk/.../idealfract.html
2
Brief History of Chromatography

• 1903 Tswett, a Russian botanist coined the term
  chromatography. He passed plant tissue extracts
  through a chalk column to separate pigments by
  differential adsorption chromatogrpahy
• 1915 R.M Willstatter, German Chemist win Nobel
  Prize for similar experiement
• 1922 L.S Palmer, American scientist used Tswetts
  techniques on various natural products
• 1931 Richard Kuhn used chromatography to separate
  isomers oh polyene pigments this is the first
  known acceptance of chromatographic methods

http//www.chemgeo.uni-hd.de/texte/kuhn.html
3
Why Chromatography?

• Chromatography is a very important technique in
  chemistry. The reason is that it can separate one
  type of molecules from others.

4

• Chromatography is an analytical technique used to
  determine the purity of a substance or to
  separate a mixture into its components.

5

• Chromatography is a non-destructive procedure for
  resolving a complex mixture into its individual
  fractions or compounds.
• This is a separation procedure and the separated
  entities are identified by other analytical
  techniques like UV-visible, Infrared, NMR
  (nuclear magnetic resonance), Mass spectrometry
  etc. In applications for quantitative analysis
  the measurement of the area under the curve in
  chromatogram is done.

6
Definition Principle in chromatography

• Definition
• Chromatography is defined as the process of
  separation of the individual components of a
  mixture based on their relative affinities
  towards stationary and mobile phases.

7

• The stationary phase refers to the solid or
  liquid to which components in a mixture bind or
  adsorb.
• The mobile phase refers to the liquid or gas that
  moves the components in a mixture over the
  stationary phase.

8

• Menurut Farmakope Indonesia IV
• Kromatografi adalah suatu teknik atau prosedur
  pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi
  diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri
  dari dua fase atau lebih yang salah satu
  diantaranya bergerak secara berkesinambungan
  dalam arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu
  menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya
  perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan,
  tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan
  ion.

9

• Menurut IUPAC
• Kromatografi adalah metode yang digunakan untuk
  pemisahan komponen dalam sampel dimana komponen
  itu terdistribusi dalam dua fase yang salah
  satunya diam dan yang lainnya bergerak.

10
Principle

•  The samples are subjected to flow by mobile
  liquid phase onto or through the stable
  stationary phase. As in the definition the
  principle involved is separation of fractions of
  mixture based on their relative affinity towards
  the two phases during their travel.
• The fraction with greater affinity to stationary
  phase travels slower and shorter while that with
  less affinity travels faster and longer.

11

• Components in a mixture are separated based on
  their different abilities to bind or adsorb to
  the stationary phase, and on their different
  abilities to desorb or dissolve in the mobile
  phase.

12
Types of Chromatography.

• Based on the mode or method employed in
  separation chromatography is broadly classified
  as
• 1. Adsorption mode Here the stationary phase is
  a solid while the mobile phase is liquid. The
  compounds travel on the stationary phase under
  the influence of mobile phase based on their
  relative adsorption to the solid stationary
  phase.

13

• 2. Partition mode In this mode both the
  stationary and mobile phase are liquids. So the
  compounds have affinity based on their partition
  into the individual liquid phases. The one with
  greater partition to stationary phase has higher
  affinity to stationary phase and vice versa.

14
Based on the nature of stationary phase it is of
two types

• a) Normal phase chromatography Here the
  stationary phase is polar in nature and hence the
  compounds with higher polarity elute out last
  while non polars come out first.

15

• b) Reverse phase chromatography Here the
  stationary phase is non-polar in nature and hence
  the compounds with lower polarity elute out last
  and vice-versa.
• In most HPLC analysis, the mode used is reverse
  phase chromatography as many of the biological,
  phytochemical compounds and even drugs are polar
  in nature.

16
Berdasarkan sifat fisika fase diam dan fase gerak
17
Berdasarkan bentuk kemasan atau geometrik fase
diam

• Kromatografi planar, dimana fase diam tersebar
  dalam bentuk lapis tipis pada lempeng kaca,
  plastic atau aluminium (KLT) atau dalam bentuk
  lembaran bahan selulosa (KK).
• Kromatografi kolom, dimana fase diam dikemas
  dalam suatu kolom gelas atau logam (KG, KC, dan
  KCSK).

18
Berdasarkan mode pemisahan

• Adsorpsi Kromatografi adsorpsi
• Partisi Kromatografi Partisi
• - Kromatografi fase terikat
• - Kromatografi pasangan ion
• - Kromatografi penekanan ion
• Pertukaran ion Kromatografi pertukaran ion
• Eksklusi ukuran Kromatografi eksklusi ukuran
• Afinitas Kromatografi afinitas

19
Berdasarkan cara pengembangan / elusi

• Pengembangan elusi (Elution Development)
• Analisis frontal (Frontal Analysis)
• Pengembangan pemindahan (Displacement
  Development) ? Pengusiran

20
(No Transcript)
21
(No Transcript)
22
(No Transcript)
23
Advantages of chromatography

• can separate very complex mixtures
• drugs, plastics, flavorings, foods, pesticides,
  tissue extracts, fuels, air samples, water
  samples, ...
• very small sample sizes
• separated components can be collected
  individually
• analyses can be highly accurate and precise

24
Column chromatography
25
What is chromatography used for?

• 1. finding concentrations
• gas chromatogram of gasoline
• ion chromatogram of orange juice

• each peak corresponds to a separate component in
  the mixture
• area of each peak is proportional to
  concentration

26

• 2. chemical fingerprinting
• species identification
• "killer" bees can be distinguished from native
  bees by comparing gas chromatograms of cuticle
  extracts
• tracing contraband sources
• detecting drugs in urine

27
What does HPLC mean?

• High pressure liquid chromatography
• High priced liquid chromatography
• Hewlett-Packard liquid chromatography
• High performance liquid chromatography
• Hocus pocus liquid chromatography
• High patience liquid chromatography

28

• High pressure liquid chromatography is
  abbreviated as HPLC. But with its efficiency it
  is High performance liquid chromatography 

29
APPLICATIONS OF HPLC

• Environmental
• Veterinary
• Agriculture
• Food
• Chemistry
• Biomedical and Clinical

30

• HPLC applications include
• detection,
• analysis,
• determination,
• quantification,
• derivation of molecules from mixtures (prep.
  hplc) of biological, plant, medical importance.

31

• HPLC theory The principle involved in HPLC
  testing is separation of compounds in a
  mixture more efficiently and also quickly than
  that of traditional column chromatography.

32

• High performance liquid chromatography is
  basically a improved form of column
  chromatography. Instead of a solvent being
  allowed to drip through a column under gravity,
  it is forced through under high pressures ( gt 400
  atmospheres ) that makes it much faster.

33

• It also allows you to use a very smaller particle
  size for the column packing material which gives
  a much greater surface area for interactions
  between the stationary phase and the molecules
  flowing past it. This allows a much better
  separation of the components of the mixture.

34
Advantages of HPLC

• HPLC method evaluates almost all the molecules of
  same family.
• For example in one single run all the
  mono-amines like dopamine, epinephrine, serotonin
  can be estimated. Single run of steroids gives
  data for all the steroids
• Molecules with small differences in absorption
  wavelengths can be detected well due to their
  differences in separation time.
• Substances in very low concentration like nano
  and picograms can be detected to sensitivity of
  HPLC detectors used.
• The quality of substance obtained by preparative
  technique (prep hplc) is of high purity.

35
Disadvantages of HPLC

• It's an expensive technique as it requires costly
  HPLC instrumentation, columns and also use of
  highest grade purity of solvents, buffers, etc.
• Working on HPLC requires heavy processing before
  estimation like filtration, degassing,
  derivatization etc.
• The systems operation requires prior hplc
  training and effective hplc troubleshooting
  skills.
• HPLC Data obtained is non-homogenous and is never
  without any noise (fluctuation) and errors during
  estimation.
• Its time consuming.

36
A flow scheme for HPLC
37
(No Transcript)
38
Aspek Praktis Teori Kolom Teori kolom dapat
digunakan sebagai petunjuk dalam mendesain
pengoperasian KCKT. Dengan teori ini dapat
dioptimasi antara resolusi, kecepatan analisis
dan jumlah sampel yang dianalisis. Upaya optimasi
hasil analisis ternyata dapat diperoleh secara
empirik dengan hanya mengubah-ubah salah satu
parameter analisis pada saat melakukan percobaan.
Kondisi dan parameter percobaan diubah-ubah
sampai akhirnya diperoleh pemisahan yang baik
dalam waktu relatif singkat sehingga jumlah
sampel yang dianalisis meningkat.
39

• Waktu retensi (tR)
• Waktu yang dibutuhkan setelah penyuntikan sample
  untuk memunculkan suatu puncak analit oleh
  detektor disebut waktu retensi dan diberi simbol
  tR.
• Puncak kecil yang muncul disebelah kiri
  merupakan puncak spesi yang tidak ditahan oleh
  kolom. Seringkali sampel atau fase gerak
  mengandung spesi yang tidak ditahan kolom, kalau
  mereka tidak mengandung spesi tersebut
  kadang-kadang perlu ditambahkan untuk
  mengidentifikasi puncak.

40

• Waktu yang tidak diretensi (tM) disebut juga
  sebagai waktu mati (dead time).
• Laju migrasi spesi yang tidak ditahan sama
  dengan laju rata-rata migrasi molekul fase gerak
  dalam kolom.

41
2. Faktor kapasitas (k) Faktor kapasitas
merupakan parameter penting yang dapat digunakan
untuk menjelaskan laju migrasi analit dalam
kolom. Untuk spesi A, faktor kapasitas kA
didefinisikan sebagai berikut
Dimana tR merupakan waktu yang diretensi
tM waktu yang tidak diretensi oleh spesi
A. VRA adalah volume retensi spesi A
VM volume fase gerak.
42

• Jika faktor kapasitas suatu spesi kurang dari
  satu maka elusinya sangat cepat berlangsung
  artinya spesi tersebut ditahan sedikit oleh kolom
  dan terelusi dekat puncak spesi yang tidak
  diretensi. Ini menunjukkan pemisahan yang jelek
  dan waktu retensi sulit diukur dengan cermat.
  Jika faktor kapasitas berkisar antara 20 sampai
  30, waktu elusinya sangat lama dan kurang berarti
  untk analisis. Faktor kapasitas antara 2 sampai
  10 menunjukkan pemisahan yang baik. Beberapa
  pustaka merekomendasikan faktor kapasitas yang
  baik adalah 1ltklt10.

43
3. Faktor selektifitas (a) Faktor selektifitas
(a) dari suatu kolom untuk spesi A dan B
didefinisikan sebagai berikut
dimana KB adalah koefisien partisi spesi B yang
lebih kuat diretensi oleh kolom KA
adalah koefisien partisi spesi A yang
lemah diretensi kolom. Dengan demikian a selalu
lebih besar dari satu (agt1) dan dapat dihitung
dari kromatogram.
44
4. Efisiensi kolom (N) Efisiensi kolom
didefinisikan sebagai jumlah lempeng teoritik
yang dapat dihitung sebagai berikut
Dimana L adalah panjang kolom H adalah
tinggi lempeng teoritik yang efektif
(HETP/ High Effective Teoritic Plate). Dengan
demikian efisiensi kolom akan meningkat dengan
semakin panjang kolom (L) dan semakin kecil harga
H.
45

• Secara empirik harga N dapat dihitung dari
  kromatogram sebagai berikut
• dimana W adalah lebar puncak.
• Kolom yang efisien dapat mencegah pelebaran pita
  sehingga menghasilkan pita yang sangat sempit.

46
5. Resolusi (R) Resolusi (R) dari suatu kolom
adalah ukuran kemampuan kolom untuk memisahkan
dua analit. Resolusi disefinisikan sebagai
berikut
Dimana tRB dan tRA adalah waktu retensi
spesi B dan A, WB dan WA adalah lebar
alas puncak spesi B dan A.
47

• Persamaan tersebut dapat dihitung langsung dari
  kromatogram, jika puncak A dan B terpisah secara
  sempurna. Satuan antara t dan W harus sama yaitu
  dalam satuan menit atau satuan volume (mL). Harga
  R 1,5 menunjukkan puncak A dan B terpisah
  dengan sempurna. Kadangkala lebar alas puncak
  sulit diukur, apalagi kalau kedua puncak
  kromatogramnya tumpang tindih.

48
Hubungan matematik untuk meneliti kinerja suatu
kolom antara resolusi (R), faktor kapasitas (k),
faktor selektifitas (a) dan jumlah lempeng (N).
dengan memperhitungkan k2 dan R1,5
49
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan
salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT
adalah kromatografi cair kolom modern, dimana
teori dasarnya bukanlah baru tetapi hasil
pengembangan dari kromatografi cair kolom klasik.
KCKT dapat dianggap sebagai pelengkap KG. Pada KG
senyawa yang akan dianalisis harus menguap atau
dapat diubah menjadi senyawa yang menguap.
Sedangkan pada KCKT, analit harus larut dalam
cairan (fase gerak). KCKT dapat digunakan untuk
menganalisis senyawa organik dan anorganik yang
pada umumnya tidak dapat menguap.
50
Banyak kelebihan metode KCKT ini jika
dibandingkan dengan metode lainnya. Kelebihan itu
antara lain
1. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu
campuran 2. Mudah melaksanakannya 3. Kecepatan
analisis dan kepekaan yang tinggi 4. Dapat
dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan
bahan yang dianalisis 5. Resolusi yang baik 6.
Dapat digunakan bermacam-macam detector 7. Kolom
dapat digunakan kembali 8. Mudah melakukan
sample recovery
51
Pada KCKT diperkenalkan penggunaan fase diam yang
berdiameter kecil dalam kolom yang efisien.
Teknologi kolom partikel kecil (3-5 µm) ini
memerlukan sistem pompa bertekanan tinggi yang
mampu mengalirkan fase gerak dengan tekanan
tinggi agar tercapai laju aliran 1-2 mL/menit.
Oleh karena sampel yang digunakan sangat kecil (lt
20 µg) maka diperlukan detector yang sangat peka.
Dengan teknoloi ini, pemisahan berlangsung sangat
cepat dengan daya pisah sangat tinggi.
52
Sistem dan Instrumen KCKT
Sistem KCKT terdiri dari dua sub sistem yaitu sub
sistem pemisahan dan sub sistem pendeteksian
(detektor). Sistem pemisahan terdiri dari
beberapa modul yaitu sistem pemasok pelarut
dengan bagian utamanya pompa yang mengalirkan
pelarut dan sampel (yang diinjeksikan melalui
injektor) kedalam kolom. Sistem pendeteksian
terdiri dari detektor yang dihubungkan pada ujung
akhir kolom.
53
Skema instrument KCKT
Tekanan POMPA Laju alir 0-3 mL/menit
500-6000 psi Fase gerak
PELARUT
Ragam
Isokratik disaring dan
gradient diawagaskan Suntikan
sampel (10-50 µL) Fase diam

KOLOM Panjang lt 250 mm Normal
silika Diameter 5 mm Terbalik ODS-OS
Ultraviolet-tampak
DETEKTOR INTEGRATOR
Indeks bias Fluorosensi Elektrokimia

KOLEKSI LIMBAH

KCKT PREPARATIF
54

• Pompa
• Sistem pompa bertekanan tinggi mengalirkan
  pelarut / fase gerak dari bejana pelarut ke kolom
  melalui pipa tekanan tinggi. Beberapa jenis pompa
  dapat digunakan untuk KCKT asal dapat memberikan
  tekanan dan pendesakan pelarut secara merata,
  tetap dan sinambung. Jenis pompa yang dipakai
  antara lain pompa pneumatik, pompa endesakan
  tetap dan pompa torak dengan pendesakan
  bolak-balik (paling banyak digunakan). Laju
  aliran pelarut dalam kolom pada umumnya sekitar
  1-3 mL/menit dengan tekanan berkisar antara
  500-6000 psi. Teknik elusi KCKT dapat dilakukan
  secara isokratik (komposisi pelarut tetap selama
  elusi) dan elusi landai (gradient, komposisi
  pelarut berubah selama elusi)

55
2. Sistem injektor sampel Penyuntikan sampel ke
dalam kolom sering menjadi masalah karena adanya
tekanan balik yang cukup tinggi. Pada awalnya
sampel diinjeksikan langsung kedalam aliran
pelarut dalam kolom dengan semprit mikro melalui
septum injektor menggunakan diafragma atau tanpa
diafragma. Sekarang yang lebih banyak dipakai
adalah sistem suntik katup kitar (loop valve).
Katup ini tidak memutuskan aliran selama proses
penyuntikan dan meningkatkan kecermatan. Katup
ini pun memberikan volume suntik yang tepat
walaupun ada tekanan balik dan tidak memerukan
lagi semprit mikro. Volume suntik biasanya 10-50
µL dengan keterulangan 0,1.
56
3. Kolom Kolom KCKT pada umumnya terbuat dari
pipa baja tahan karat. Panjang kolom antara 10-30
cm dengan diameter dalam 4,5-5,0 mm. Kolom diisi
dengan kemasan yang sesuai diperlukan untuk
pemisahan tertentu. Dikenal dua jenis kolom yaitu
kolom preparatif dan kolom analitik. Kolom yang
digunakan untuk pemisahan analitik umumnya
mempunyai diameter dalam yang kecil (2-4 mm).
Kolom dapat dipanaskan sampai 60oC agar
dihasilkan pemisahan yang lebih efisien. Jika
tidak dinyatakan lain, kolom dipertahankan pada
suhu kamar. Ujung-ujung kolom dihubungkan dengan
pipa baja tahan karat atau pipa lainnya melalui
fiting dan terminator dari pompa/injektor di
ujung yang satu dan pada ujung yang lain
dihubungkan dengan detektor. Arah pengaliran fase
gerak harus selalu sama. Mengingat pengemasan
sendiri sangat sulit dan juga bahan fase diamnya
mahal, maka biasanya kolom KCKT tidak disiapkan
sendiri melainkan dibeli dari produsen tertentu.
57
4. Detektor Detektor dihubungkan dengan pipa
baja tahan karat atau pipa jenis lainnya dengan
ujung keluaran kolom. Detektor memantau aliran
pelarut yang keluar dari kolom dalam waktu yang
sebenarnya. Jenis detektor yang dipakai untuk
deteksi adalah detektor indeks bias, ultraviolet
sinar tampak, fluoresensi, elektrokimia dan
spektrometri massa. Pada umumnya, respon yang
berasal dari detektor diperkuat dahulu sebelum
disampaikan pada alat perekam otomatis. Dapat
pula respon ini dikirimkan kesuatu integrator
digital elektronik untuk mengukur luas puncak
kromatogram secara otomatik.
58
Pengembangan Metode Analisis
Tujuan pengembangan adalah untuk memperoleh suatu
metode yang sesuai memenuhi syarat, cermat dan
seksama, resolusi dan selektivitas tinggi, cepat,
sensitif dan reprodisibel.
Langkah-langkah yang ditempuh adalah
1. Pengumpulan informasi Informasi yang penting
itu mencakup jenis komponen yang akan dianalisis
termasuk sifat-sifat fisikokimianya yaitu
struktur molekul, bobot molekul, keasaman dan
kebasaan, spektra UV, rentang kadar, data
kelarutan dan matriksnya (bentuk sediaan, pengisi
dan cairan biologi, dll)
59
Pertanyaan dibawah ini sering digunakan untuk
memandu kita dalam mencari data pustaka a.
Apakah identitas komponen sudah diketahui? b.
Apakah senyawa pembanding kimianya sudah
diketahui? c. Berapa kadar komponen itu dalam
sampel? d. Berapa banyak sampel yang harus
dianalisis? e. Berapa tingkat kecermatan dan
keseksamaan analisis yang harus dipenuhi? f.
Adakah metode yang mirip dengan pustaka? g.
Apakah semua sarana dan prasarana analisis sudah
siap tersedia? (termasuk atriks simulasi?)
60
Setelah informasi diperoleh kita perlu menyusun
rencana strategi (jangka pendek) analisis secara
tertulis. Untuk KCKT tiga sifat fisikokimia yang
penting yang harus diketahui dari sampel yaitu
bentuk sampel, bobot molekul dan kelarutannya.
Disamping itu kita harus sudah yakin bahwa analit
yang ada dalam sampel dapat dideteksi dengan
detektor yang ada.
61
Pada umumnya sampel yang akan dianalisis
berbentuk a. Larutan yang siap diinjeksikan b.
Larutan yang memerlukan pengenceran, pendaparan
atau penambahan cairan yang lainnya c.
Larutan yang mengandung bahan asing dan perusak
kolom yang harus dihilangkan dengan cara
ekstraksi cair- cair atau padat cair d. Zat
padat yang larut air atau fase gerak yang
digunakan e. Campuran berbagai bahan dalam suatu
matriks tertentu, dalam hal ini analit harus
diisolasi dengan cara ekstraksi
62
Tiga bentuk sampel yang terakhir perlu dilakukan
prae treatment agar diperoleh larutan analit
yang siap diinjeksikan ke dalam kromatograf.
Dalam tahap ini sudah dipikirkan apakah perlu
metode baku internal atau baku tinambah agar
kecermatan dan kesaksamaan analisis dapat dicapai
dengan baik.
63
2. Pemilihan detektor Detektor adalah suatu
instrumen yang dihubungkan pada ujung akhir suatu
kolom yang berfungsi memantau analit yang
dipisahkan kolom. Beberapa persyaratan yang harus
dipertimbangkan dalam memilih detektor adalah
linier antara respon dengan konsentrasi, kepekaan
tinggi, ketepatulangan, volume mati sel serendah
ungkin dan mudah perawatannya.
Pilihan pertama detektor ditujukan pada detektor
UV panjang gelombang tertentu, misalnya 254 nm.
Ini dipilih karena banyak senyawa yang menyerap
radiasi pada panjang gelombang ini. Jika detektor
ini tidak memadai maka pilihan berikutnya pada
detektor panjang gelombang beragam (multiple
wavelength). Panjang gelombang pengukuran
dipilih berdasarkan serapan maksimum dan
absorptivitas molar (e) analit yang akan
dianalisis.
64
3. Pemilihan kolom Kolom pada KCKT merupakan
faktor yang sangat menentukan karena didalam
kolomlah pemisahan berlangsung. Kolom yang baik
harus memberikan resolusi yang baik dengan waktu
pemisahan yang tidak lama (lt20 menit). Kolom KCKT
berupa pipa baja tahan karat, gelas atau plastic
yang berisi fase diam. Fase diam dapat berupa zat
padat (pada kromatografi adsorpsi) atau berupa
zat cair yang disaput pada partikel silika
berpori, tetapi sekarang berupa fase terikat
secara kimia pada suatu penyangga (paka
kromatografi partisi)
65
Kolom HPLC
Injector
66
Untuk mengikat fase diam pada penyangga silika
secara kimia telah digunakan tiga cara dasar.
Semuanya melibatkan reaksi dengan gugus silanol
(-Si OH) yang reaktif pada permukaan silika.
Reaksi pertama berdasarkan reaksi eterisasi,
reaksi kedua berdasarkan reaksi silisasi dan yang
ketiga berdasarkan reaksi alkilasi Grignard. Pada
dasarnya sejumlah besar gugus fungsi dapat diikat
oleh gugus silanol penyangga. Tapi gugus yang
paling umum dipakai adalah oktil, oktadekil,
fenil, alkilamina dan alkil nitril.
67
4. Pemilihan fase gerak Fase gerak memegang
peranan penting dalam pemisahan analit karena
migrasi analit diatur oleh interaksi fase gerak
dan fase diam. Migrasi analit terjasi karena
adanya kompetisi antara fase gerak dan analit
untuk dapat terikat pada sisi-sisi aktif dari
fase diam. Fase gerak yang dipakai biasanya
merupakan campuran 2 atau lebih pelarut yang
kekuatannya berbeda.
Pelarut yang kepolarannya berbeda jauh dengan
kepolaran fase diam dianggap sebagai pelarut yang
lemah, karena pelarut jenis ini tidak akan
ditahan kuat oleh fase diam dan belum tentu dapat
mengusir analit dari ikatannya dengan fase diam
untuk bermigrasi. Pelarut jenis ini mempunyai
kepolaran yang tidak berbeda jauh dengan fase
diam.
68
Sifat fisika-kimia pelarut yang harus
diperhatikan untuk memilih pelarut yang dipakai
dalam KCKT adalah viskositas, kompresibilitas,
indeks bias, tekanan uap, titik leleh, spektrum
UV, nilai ambang batas, daya campur dan
kepolaran. Disamping itu pelarut yang dipakai
dalam KCKT harus murni secara kimia, bebas
partikel, bebas dari gas terlarut, dicampur
dengan benar dan taat asas.
69
5. Penentuan kondisi dan kesesuaian sistem Bila
memakai KCKT pada umumnya dkehendaki adanya
kepastian kesesuaian dan kondisi percobaan yang
dilakukan. Penentuan ini disebabkan karena adanya
pengaruh kondisi yang disebabkan jenis peralatan
sistem elektronik, zat uji dan kualita pereaksi
yang digunakan terhadap hasil analisis.
Kondisi percobaan yang harus ditetapkan meliputi
laju aliran pelarut, suhu kolom, kecepatan kertas
perekam, attenuation dan nilai ambang yang
digunakan (tinggi puncak, luas, lebar
kromatogram). Untuk KCKT perlu ditetapkan juga
keberulangan dari penyuntikan, waktu retensi,
faktor ikutan, dll, sesuai dengan uji kesesuaian
sistem yang tertera dalam Farmakope.
70
Kriteria penentuan kondisi percobaan dan
kesesuaian sistem
Parameter Percobaan Kriteria
1. Keberulangan penyuntikan 2. Laju aliran 3. Tekanan 4. Waktu pemisahan 5. Faktor kapasitas 6. Faktor selektivitas 7. Faktor ikutan / simetris 8. Kromatogram 9. Resolusi 10. Penggunaan pelarut 11. Efisiensi kolom Koefisien variasi lt 2 1-2 mL/menit 100 200 bar 10 20 menit 1ltklt10 agt1 Tf1 Lancip, tajam tidak melebar dan tak berekor R1,5 minimal N10.000/m
71
(No Transcript)
72
(No Transcript)
73

• Kromatografi merupakan teknik pemisahan yang
  mana senyawa kimia/obat terpisah oleh perbedaan
  kecepatan elusi yang dikarenakan oleh senyawa ini
  melewati kolom kromatografi
• Solut atau analit adalah senyawa oobat yang
  dianalisis
• Pemisahan solut-solut diatur oleh distribusi
  solut dalam fase gerak dan fase diam.

74

• Komponen-komponen utama pada KCKT
• Wadah fase gerak
• Pompa untuk mengalirkan fase gerak
• Alat untuk memasukkan sampel
• Kolom
• Detektor
• Wadah penampung buangan fase gerak
• Tabung penghubung
• Komputer/integrator untuk mengolah data sinyal
  sehingga diperoleh suatu kromatogram

75

• Wadah fase gerak
• merupakan untuk menampung fase gerak yang
  digunakan selama proses pemisahan dengan KCKT.
  Wadah ini harus bersih dan lembam (inert) atau
  tidak bereaksi dengan komponen fase gerak. Wadah
  bisa berupa wadah pelarut kosong atau labu
  laboratorium.

76

• Fase gerak
• Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas
  campuran pelarut yang dapat bercampur dan secara
  keseluruhan berperan dalam daya elusi dan
  resolusi. Daya ini ditentukan oleh polaritas
  keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan
  sifat komponen-komponen sampel.

77

• Fase gerak harus berinteraksi dengan fase diam
  yang sesuai untuk memisahkan campuran senyawa
  obat secepat dan seefisien mungkin.

78

• Kriteria pemilihan fase gerak
• Viskositas
• pelarut dengan viskosias rendah menghasilkan
  tekanan yang lebih rendah dibandingkan pelarut
  dengan viskositas tinggi pada suatu kecepatan
  alir tertentu. Viskositas rendah juga
  memungkinkan kromatografi yang lebih cepat karena
  perpindahan masa berlangsung lebih cepat.

79

• 2. Transparansi terhadap uv
• jika detektor uv yang digunakan maka fase gerak
  harus transparan secara sempurna pada panjang
  gelombang yang digunakan. Transparansi
  garam-garam buffer, reagen-reagen pasangan iondan
  bahan tambahan lain juga harus diperhatikan.

80

• 3. Indeks bias
• penting jika detektor indeks bias yang
  digunakan. Perbedaan indeks bias antara pelarut
  dengan sampel harus besar jika bekerja dengan
  batas-batas deteksi tertentu.

81

• 4. Titik didih
• titik didih fase gerak yang rendah diperlukan
  jika eluat akan dilakukan pemprosesan lebih
  lanjut supaya memudahkan dalam penguapannya. Di
  satu sisi pelarut dengan tekanan uap tinggi (TD
  tinggi) pada suhu kamar cendrung menghasilkan
  gelembung-gelembung uap dalam detektor.

82

• 5. Kemurnian
• tidak adanya senyawa yang mengganggu pada bentuk
  deteksi yang digunakan, tidak adanya senyawa yang
  mengganggu elusi gradien (berguna untuk
  meningkatkan resolusi campuran yang kompleks
  terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas
  yang luas), tidak adanya residu non-volatile
  dalam kasus pemisahan preparatif.

83

• 6. Lembam (inert) terkait dengan senyawa-senyawa
  sampel
• fase gerak harus tidak bereaksi sama sekali
  dengan campuran sampel. Jika sampel yang
  sianalisis sangat peka terhadap oksidasi maka
  fase gerak dapat ditambah senyawa antioksidan.

84

• 7. Toksisitas
• seorang analis harus menghindari penggunaan
  produk yang toksik semaksimal mungkin. Pelarut
  terklorinasi dapat melepaskan gas fosfen yang
  sangat toksik. Toluen harus menggantikan benzena
  yang bersifat karsinogenik, kapanpun dimungkinkan.

85

• 8. Harga
• Fase gerak yang paling sering digunakan untuk
  pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran
  larutan buffer dengan metanol atau campuran air
  dengan asetonitril.
• Untuk fase normal fase gerak yang sering
  digunakan adalah campuran pelarut hidrokarbon
  dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan
  pelarut jenis alkohol.

86

• 3. Pompa pada KCKT
• syarat pompa adalah inert terhadap fase gerak.
  Bahan yang umum dipakai pada pompa adalah gelas,
  baja tahan karat, teflon dan batu nilam. Pompa
  yang baik mampu memberikan tekanan sampai 5000
  psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan
  kecepatan alir 3 ml/menit. Untuk tujuan
  preparatif pompa yang digunakan harus mampu
  mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20
  ml/menit

87

• Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran
  fase gerak adalah untuk menjamin proses
  penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,
  reprodusibel, konstan dan bebas dari gangguan.

88

• 4. Alat untuk memasukkan sampel
• Sampel cair dan laruan disuntikkan secara
  langsung kedalam fase gerak yang mengalir dibawah
  tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik
  yang terbuat dari tembaga ahan karat dan katup
  teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel
  internal atau eksternal