L

1
Lapoptose
Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP,
37380 Nouzilly
2
I. Définitions et processus
3
La mort cellulaire

• 2 types de mort cellulaire
• apoptose
• Nécrose
• Apoptose Mort cellulaire programmée  ou
  Programmed Cell Death (PCD)
• PCD phénomène essentiel dans de nombreux
  processus physiologiques et pathologiques

4
Rôles de la mort cellulaire

• Elimination des  surplus  de cellules saines
• Embryologie (cavités, morphogénèse, structures
  vestigiales, cellules  en trop )
• homéostasie constance de la masse cellulaire
• processus physiologiques (cellules mammaires,
  endomètre, cellules épithéliales)
• Suppression des cellules endommagées (défauts
  génétiques, vieillissement, maladies, agents
  toxiques)
• Régulation des populations cellulaires (ex.
  élimination régulée de certaines populations
  cellulaires immunitaires)

5
Apoptose et Nécrose
Se différencient par

• Leurs mécanismes et modalités de déclenchement
• la morphologie des cellules
• les conséquences tissulaires
• leurs significations biologiques

6
Apoptose vs Nécrose

• Atrophie
• Intégrité organelles et membrane
• Condensation du noyau
• Bourgeonnement de la membrane
• Fragmentation ( corps apoptotiques )
• Phagocytose / C voisines
• Pas d inflammation

• Turgescence
• Lyse des organelles et des membranes
• Pas de condensation
• Rupture des membranes
• Libération du contenu cellulaire
• Lyse de la chromatine
• Phagocytose tardive
• Inflammation

7
Apoptose
Nécrose
8
Photo Molecular Probes
9
1. Nécrose membrane et organelles Altérées,
noyau conservé x 10 000 (TEM) 2. Apoptose (A)
réarrangement de la chromatine (vs normal N),
membrane x 8000 (TEM) 3. Nécrose (SEM) x
5000 4. Apoptose (SEM) bourgeonnements x
5000 5. Cellule normale pores nucléaires x 30
000 (FF) 6. Apoptose confluence des pores
nucléaires x 35 000 (FF)
10
Remarques

• Etats intermédiaires
• facteurs déclenchants communs
• importance des ressources énergétiques (ATP)
• succession apoptose puis nécrose
• Etat apoptotique  fugitif  inaperçu
  (phagocytose très rapide)

11
Un schéma simple Caenorhabditis elegans
3 étapes 1) apparition de signaux (externes ou
internes) 2) activation de protéases
cellulaires 3) formation des  corps
apoptotiques  et phagocytose
Signal
Inactivation
Inactivation
EGL-1 ----gt CED-9 ----gt CED-4 ----gt CED-3
----gt Apoptose
CED-3
activé
Membrane C
Etape intra cellulaire
12
Schéma général de l apoptose
T cell CD8
Ca
TNF Fas
Conditions physico-chimiques
NK
Perforin Granzyme B
Bcl2-pro
Récepteurs de mort
Bcl2-anti
Caspase 8
Mitochondrie
Dégranulation
P53
AIF
Cytochrome C
Cyclines
Caspase 9
Caspases effectrices Caspase 3 (Caspases 6
et 7)
ADN, noyau
13
Les signaux déclencheurs

• Déclencheurs extra-cellulaires
• Souvent communications entre cellules
• insuffisance de signaux suppresseurs de  PCD 
• augmentation de signaux inducteurs
• Déclencheurs intra-cellulaires
• réponse à des stimuli ou à des perturbations
  métaboliques

14
!
Combinaison des 2 types de signaux
Les récepteurs ont des rôles multiples (ex
prolifération, différenciation, survie)
Rôle différent du récepteur selon type
cellulaire ex. récepteurs des stéroïdes
Différents mécanismes d induction souvent
associés
15
Insuffisance de signaux suppresseurs
Signaux extra-cellulaires

• Cultures cellulaires concentration, sérum,
  diverses molécules solubles ou liées à la
  membrane
  (variations selon le type cellulaire)
• Liaison cellules cibles
• ex. neurones adaptation au nombre de cibles

Augmentation de signaux inducteurs
Ex perte queue des têtards rôle de l hormone
thyroïdienne
16
Signaux intra-cellulaires
lésions de la cellule produites par drogues,
toxines, chaleur, radiations, hypoxie, virus qui
ne sont pas des  inducteurs  spécifiques
 seuil de lésions  déclenchement de
la PCD activation des caspases, de protéines
proapoptotiques (voie p53 dépendante) ou
protéines kinases
17
Induction in vitro
Fas ou Ac anti Fas (CD95) TNF ou ligands du
TCR Pas de sérum ou de facteur de
croissance UV H2O2 Glucocorticoides Ionophore
calcium Camptothecine Contact lymphocytes T
cytotoxiques ou NK activés concentration
cellulaire, équilibre de populations
Temps nécessaire 2 à 6 h
18
Voie Fas-L (CD 95) Fas
Fas-Ligand
Membrane cellulaire
Fas (trimérisation)
FADD
Fas Associated protein with Death Domain
Pro Cas 8
Cas 8
Pro Cas 3
Autres Cas
19
Apoptosome
??m
Cytochrome C
dATP
Pro Cas 9
Cyt C
(AIF)
Apaf-1
Caspase 9
Apaf-1
Cyt C
Pro Cas 9
AIF Apoptosis Inducing Factor Apaf-1
Apoptosis protease activating factor 1
20
Les caspases
C aspases
Cystéines protéases, résidus acide aspartique
14 caspases et pro-caspases
3 groupes, selon affinité de substrat I 1, 4,
5 ---gt
inflammation II 2, 3, 7 CED-3
---gt apoptose III 6, 8, 9
---gt  
Activation des caspases  entre elles 
 cascade  irréversible
21
Rôle très important de la caspase 3 exécuteur-clé
(qq soit le stimulus)
Régulation de la cascade par des protéines
activatrices inhibitrices APAF1
Bcl2 FADD RIP FLASH Bcl2
Activation en présence de ATP cytochrome
C (rôle de la mitochondrie)
22
La famille des Bcl2
Action sur les membranes mitochondriales
libération ou non du cytochrome C (proApo
ou antiApo)
Bax Bak Bok Bik Bin Bad Bid Mbrane
mitochondrie (Bad Bid cytosol)
Bcl2 Bclxl Bclw Mcl1 Nr13 Al/Bfl1 ( inhibe
Cas9)
formation homodimères ou hétérodimères
régulation
23
II. Méthodes danalyse de lapoptose
24
Membranes cellulaires Translocation des
phosphatidylsérines (Annexin V)
Mitochondries Potentiel de membranes (sondes
fluorescentes) Libération du cytochrome C (Ac
ELISA) Libération de AIF  Apoptosis inducing
factor  (Ac ELISA) Noyau Clivage de
l ADN - Ac anti-histones - fragments (180 pb)
gel d agarose ( DNA ladder ) - TUNEL ou TdT
extrêmités 3OH - nucléosomes (ELISA)
Libération des  Nuclear Matrix Proteins  (NMPs)
Ac
25
Dosages de molécules Récepteurs des signaux
Ac FAS-L (ou Apo-1 ou CD95) TNF
Caspases Ac ou activités enzymatiques (substrats
spécifiques) gt fluorescence) Protéines
régulatrices (pro ou anti) Ac Glutathion
calcium Gènes impliqués
26
Cytométrie en flux et étude de lapoptose
27
Principe de la cytométrie en flux

• Cellule par cellule, quantification de la
  fluorescence

• Plusieurs paramètres simultanément pour chaque
  cellule (jusqu'à 11 paramètres dont 8
  fluorescences)
• Sélection de populations (analyse et tri)
• Analyse de cellules vivantes, grand nombre en
  peu de temps

28
2 types de signaux

• Signaux de diffusion de lumière diffusion
  frontale de la lumière FSC Forward Scatter
  diffusion latérale de la lumière SSC Side
  Scatter
• Signaux de fluorescence couleur démission de
  fluorescence violet, bleu, vert, jaune,
  orange, rouge

29
Spectres dexcitation et démission de la
fluorescéine
Spectre dexcitation
Spectre démission
Invitrogen Molecular Probes
30
Analyse monoparamétrique exemple la
fluorescence
Témoin autofluorescence des cellules
Après marquage spécifique
Nombre de cellules par classe dintensité
( canal )
Intensité de fluorescence verte gt échelle
exprimée en unités arbitraires ou canaux
Population pure gt une gausssienne
31
Analyse biparamétrique exemple de deux
fluorescences

• double marquage amélioration de la
  discrimination entre les populations
• cellules positionnées en fonction coordonnées
  sur les 2 axes

Population doublement marquée
Populations simplement marquées
Population non marquée
Intensité de fluorescence rouge
Intensité de fluorescence verte
32
Analyse multiparamétrique
Sélection des cellules sur les paramètres de
diffusion de lumière
33
Analyse multiparamétrique
Marquage avec un anticorps un anti-lymphocytes T
Cellules mortes
Cellules en apoptose
Cellules vivantes
région 1
Nombre de cellules par classe dintensité
( canal )
région 2
Cellules mortes
Cellules en apoptose
Cellules vivantes
Intensité de fluorescence orange
34
Le tri et ses options

• Pourquoi trier ?
• Vérification des analyses
• Autres analyses (cytométrie ou autre
  méthodologie)
• Mise en culture (tri  stérile )
• Comment trier ?
• Une à quatre populations différentes
• Vitesse de tri maximum 50000 Cellules/s
• Support lames, tubes, plaques à
  microtitration
• Milieu  coussin , PBS, RPMI ( SVF)
• La pureté, la viabilité, la stérilité

35
Principe du tri par cytométrie
A
Buse
Rayon laser
Analyse
F
Drop delay
 Break off 
Gouttelettes détachées
Plaques de déflection
- 2500 V
2500 V
36
Exemple de tri par cytométrie
Analyse avant tri
Réanalyse après tri
99.6 de pureté
Drouet-Viard (2001)
37
Etapes principales de lapoptose analysées en
cytométrie
Récepteurs de mort
calcium
Pro Bcl2AntiBcl2
Potentiel de membrane
membrane
mitochondrie
récepteursaltérations
identification activité
caspase
Fragmentation  Nuclear Matrix Protein (NMP)
noyau
38
Mise en évidence des récepteurs de mort
Fixation ligand spécifique gt formation complexe
multiprotéique

• Anticorps dirigés contre les
• récepteurs de mort fonctionnels
• anti Fas (anti CD95)
• anti TRAIL (anti DR3,DR4,DR5)
• anti DCR2, DCR3
• gt réaction immunofluorescence directe ou
  indirecte

Kyung-Mi Kim et al (2000). Experimental and
molecular medicine 32, 246-254.
39
Mise en évidence des protéines agissant au niveau
mitochondrial

• Anticorps dirigés contre
• les protéines proapoptotiques Bax
• les protéines antiapoptotiques Bcl2
• la forme tronquée de Bid (obtenu après action
  caspase 8)

Perianayagam et al (2003). European Journal of
Clinical Investigation 33, 905-911.
40
Variation du calcium intracellulaire
Etape précoce de lapoptose gt augmentation du
calcium intra-cellulaire

• mesure du flux de Ca gt Fluo3
• mesure quantitative du Ca
• - Fura-2 modification spectre dexcitation
• - Indo-1 modification spectre démission
  fluorochrome libre émission 475nm
  (B)fluorochrome lié émission 400nm
  (A)mesure ratiométrique sonde liée/sonde libre

Spectre d émission de l indo-1
41
Variation de calcium intracellulaire utilisation
du fluo-3
Cellules témoins
Cellules traitéesVérapamil
Induction apoptose par la roténone sur des
cellules neuronales
Cao QZ et al (2005). World J Gastroenterol Apr
2111(15)2255-9.
WangXJ, Xu JX (2005). Neuroscience Letter Mar 11,
376(2) 127-32.
42
Modifications membranaires

• Modification graduelle de la perméabilité
  membranaire
• pénétration plus facile Hoechst 33342 ou
  Yo-Pro1
• Perte de lassymétrie membranaire
  externalisation des phospholipidesAnnexineV
  reconnaît les phosphatidylsérines
• Etude du désordre lipidique membranaire
• externalisation des phosphatidylsérines gt
  modification organisation membranaire gt
  augmentation fixation merocyanine 540
• discrimination cellules mortes-cellules vivantes

43
Externalisation des phosphatidylsérines
Cellules mortes
Intensité de fluorescence rouge (7AAD)
Cellules vivantes
Cellules en apoptose
Intensité de fluorescence verte (annexine V FITC)
Résultats A-M Chaussé (1996)
44
Externalisation des phosphatidylsérines
Lignée de cellules T humaines, coloration
annexineV Alexa 488 et Iodure de propidium Photo
Molecular Probes
Cellule en nécrose
Cellule en apoptose
45
Modifications dans la mitochondrie

• Action protéines proapoptotiques (Bax)
• Ouverture des pores de transition
• modification équilibre ionique dépolarisation
  de la membrane mitochondriale
• libération cytoplasmique du cytochrome c
• libération cytoplasmique des protéines
  SMAC/Diablo
• libération cytoplasmique des AIF

46
Mise en évidence de la dépolarisation de la
membrane
fluorochromes cationiques et lipophiles
incorporation potentielle dépendante gt variation
du potentiel mitochondrial exemple DiOC6,
Rhodamine 123, MitoTracker, JC-1

• mitochondries fonctionnelles multimères gt
  fluorescence rouge
• mitochondries non fonctionnelles monomères gt
  fluorescence verte

JC-1
Cellules normales
Cellules en apoptose
Intensité de fluorescence rouge
Cellules mortes
Daprès Salvioli S. et al. (2000) Cytometry
40189_197
Intensité de fluorescence verte
47
Incorporation d un fluorochrome cationique le
JC-1
Coloration d une lignée de fibroblastes au JC-1,
différents temps de stimulation de l apoptose
Photo Ildo Nicoletti, Perugia University
Medical School.
48
Mise en évidence de la libération cytoplasmique
du Cytochrome C

• Anticorps dirigés contre le Cytochrome C

Act D
-Act D
Coloration dune lignée de cellules T
humaines Photo et Histogramme Merck Novagen
49
Activité enzymatique des caspases

• gt
• forme active anticorps
• site actif de lenzyme Peptide spécifique
  (FLICA)
• quantification de lactivité enzymatique

Procaspases précurseurs inactifs
Caspases actives
Caspase active
Substrat non fluorescent produit fluorescent
50
Exemple de mesure de lactivité enzymatique

• monoparamétrique activité caspase

• biparamétrique activité caspase et ploïdie

Quantité d ADN (Iodure de Propidium)
Cellules en apoptose
Activité caspase (FITC)
F. Guérif, V. Cadoret et D. Royère (2001)
51
Fragmentation de l ADN

• En fin de cascade apoptotique il y a activation
  de nucléases qui coupent l ADN entre les
  nucléosomes
• méthode TUNEL
• Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick
  End Labeling
• méthode du pic hypodiploïde

52
Méthode TUNEL
Enzyme Tdt fixe des désoxynucléotides non
fluorescents ou fluorescents sur lextrémité 3OH
libre.
Cellule en apoptose
Cellule en nécrose
Photo Molecular probes
53
Méthode TUNEL

• Utilisation de la ChromaTide BODIPY FL-14-dUTP
• apoptose en cours gt fluorescence verte
• apoptose terminale fragmentation nucléaire
  intense gt fluorescence jaune

Photo Zbigniew Darzynkiewicz, Cancer Research
Institute, New York Medical College.
54
Méthode du pic hypodiploïde
coupure entre les nucléosomes gt quantité ADN lt
2C quantification ADN avec un fluorochrome
intercalant spécifique (Iodure de propidium,
Bromure déthidium)
Cellules normales
Cellules en apoptose
Pic G2/M
Nombre de cellules par classe d intensité
( canal )
Pic G0/G1
Intensité de fluorescence rouge (Iodure de
Propidium)
Résultats M. Afanasieff (1993)
55
III. Apoptose et Infectiologie
56
Pathologies associées à l apoptose
Apoptose insuffisante Maladies autoimmunes Leucémi
es Syndromes lymphoprolifératifs Tumeurs Ostéoporo
se Malformations Rejet de greffe Maladies virales
(poxvirus, adenovirus) Maladies parasitaires
(Toxoplasmose, Leishmaniose)
Apoptose excessive Alzheimer Parkinson SIDA Hépati
tes Certains diabètes Malformations Rejet de
greffe virus, bactéries Toxines
57
Trois exemples dapoptose en pathologie
infectieuse

• Mort du macrophage infecté par des salmonelles
• Rôle de lapoptose dans les relations
  Plasmodium-vecteur
• Virus et régulation mitochondriale de lapoptose

58
A) SalmonelloseK. HUEFFER and JE Galan,
Cell.Microbiol., 2004, 6, 1019-1025

• Co-évolution pathogène-hôte modulation des
  relations (ex. fonctions/mort macrophage)

59
Les TTSS de Salmonella

• Salmonelles ? 2 Type III protein secretion
• system ou TTSS

• SPI-1 stimulée par faible O2 et forte
  osmolarité phase dinvasion intestinale
• SPI-2 stimulée par faible Mg et pH acide
  (intra-cellulaire) infection systémique
• Les 2 protéines induisent la mort du macrophage
  mais différents mécanismes et temps 45 min
  (SPI-1 ?) ou 24 h (SPI-2 ?)

60
Les questions

• Sagit-il dune PCD ou dune nécrose ?
• Mécanisme typique de PCD ?
• Mort identique pour tous les macrophages ?
• Conséquences pour le pathogène et pour lhôte ?

61
PCD ou nécrose ?
témoins
- fragmentation chromatine - activation caspase
3 - nucléosomes dans cytoplasme
- perte intégrité membrane - pas dactivation
caspase 3 - altération des organites
nécrose
apoptose
62
Mécanisme typique de PCD ?

• Rôle clé de la Caspase 1
• Inhibiteurs de caspases inactifs
• Cytotoxicité courte ou longue
• Pas dactivation de la caspase 3
• Différences selon les macrophages

• Existe sans Caspase 1
• Action de protéines effectrices délivrées par
  TTSS ?
• Régulation pro ou anti-apoptotique ?
• Action indirecte (ex dégradation de lactine

Conclusions apoptose par différents mécanismes
63
Conséquences

• Stimulation du PCD / salmonelles pour limiter la
  réaction de lhôte ?
• Réponse de lhôte pour limiter linvasion
  bactérienne ?
• Souris caspase-1- sont plus résistantes moins
  pénétration des salmonelles dans la muqueuse ?

64
B) le Plasmodium et son vecteurH. Hurd and V.
Carter, 2004, Int J Parasitol., 34, 1459-1472
65
Les observations

• PCD chez le parasite, le vecteur et lhôte
• - Chez le parasite et chez le vecteur
• images caractéristiques de PCD
• blocage par les inhibiteurs de caspases
  des métazoaires
• - Chez lhôte
• liaison présence du parasite et mort CD4
  et CD8 ( du Fas)

66
PCD chez le parasite

• Pas dhomologues de caspases dans le génome ?
  autres cystéine protéases ?
• méta et para caspases
• dont calpaine, cathepsine
• Différences pour létape mitochondriale
• (pas de p53, AIF, Apaf1 et Bcl2)
• Ressemblances pour les signaux inducteurs
• Heat shock, médicaments, lectines (con A),
  sérum, ROS, NO (moustique et hôte producteurs
  )

67
PCD dans le tube digestif du moustique (1)

• Pas un type cellulaire précis
• Ensemble de caractéristiques communes
  post-invasion parasitaire (très lié à la
  chronologie du cycle et du stade parasitaire)
• Présence de caspase-3 like
• Déclenchement par simple contact parasitaire
• élimination des cellules endommagées et/ou
  libération du parasite ?
• Le parasite séchappe intact alors que sensible
  aux inducteurs et présence de NO ( seuils ?)

68
PCD chez le moustique (2)

• Réduction de fécondité du moustique / le parasite
  ( mRNA de vitellogénine) et PCD cellules
  folliculaires (reversible avec inhibiteur de
  caspase)
• Réponse adaptative du vecteur vs stress de son
  parasitisme ? Un stress physiologique à la fois ?
• Optimisation par le parasite de la survie de
  son hôte pour sa propre maturation ? Intérêt à
  ménager lhôte

69
C) Virus et modulation de PCD dans la
mitochondrieP. Boya et al., 2004, Biochem.
Biophys. Acta, 1659, 178-189

• Virus peuvent
• 1) augmenter PCD (dissémination,
  immunosuppression)
• 2) réduire (réplication)
• Variation selon les familles de virus
• Différentes voies daction sur PCD (TNF, PKR,
  P53, caspases, mitochondries)

70

• Mitochondries gt action MMP ,
  (Mitochondrial Membrane Permeabilisation)
• point central clé
• Virus avec
• 1) induction 2) inhibition de MMP
  (début du cycle) (fin du
  cycle infectieux)
• MMP déclenchée par
• gt Voie externe death receptors , caspases,
  MMP)
• gt Voie interne action directe mitochondriale
• mitochondrial targeting sequence MTS)

71
Mécanismes anti-apoptotiques

• Exemple du KSHV (herpes virus sarcome de
  Kaposi et maladies lymphoprolifératives)
• Différentes protéines virales anti-PCD dont 2
  localisées dans mitochondries (K7 et K15)
• K7 contient un MTS
• K7 bloque MMP induit par TNF-a, CD45 death
  receptor ligand, Bax
• K7 a un domaine formant un pont Bcl-2 et caspase
  3 activée
• K7 régule aussi la voie du calcium

72
Antiapoptotic viral proteins acting at the
mitochondria
Virus Protein Intracellular Localization Partners Cellular homologs Protects cells from
CMV vMIA M Bax, ANT Oxidants, anti-Fas, Bax, tBid, TN, TG, STS, BFA, NFX, CPX, HCQ
Myxoma M11L M PBR STS, anti-Fas, PPIX
Vaccinia F1L M STS, anti-Fas
KSHV K7 or vIAP M, ER, PM CAML, Bcl-2, activated caspase 3 Survivin delta-Ex3 TG, TNF-a, anti Fas
K15 M, ER HAX-1
EBV BHRF1 M Bcl-2 TRAIL, t-BHP, DNA damage, virus infection
HCV NS2 ER (M with CIDE-B) CIDE-B CIDE-B
73
Mécanismes pro-apoptotiques

• Exemple du HBV (hépatite B) Protéine X (HBx)
• Essentielle pour réplication virale, oncogène
• Sensibilisation des hépatocytes au PCD induit par
  stimuli (TNF-a, TRAIL)
• Localisation mitochondriale, perte du ??m, mort
• MTS identifiée et fonctions précisées
• HBx interagit avec 2 protéines mitochondriales
  (HSP60 et VDAC3)
• Protéines anti-PCD (Bcl2 et Bcl-Xl) protègent
• VDAC3 rôle pathogène (hépatite chronique et
  carcinogénèse) ???

74
Proapoptotic viral proteins acting at the
mitochondria
Proapoptotic viral proteins acting at the
mitochondria
Abbreviations AEV, avian encephalitis virus
ANT, adenine nucleotide translocase BLV, bovine
leukemia virus C, cytosolic ER, endoplasmic
reticulum FPPS, farnesylpyrophosphate
synthetase HBV, hepatitis B virus HIV-1, human
immundeficiency virus-1 HPV, human
papillomavirus HSP, heat shock protein HTLV-1,
human T leukemia virus-1 IAV, influenza A virus
M, mitochondria N, nucleus VDAC,
voltage-dependent anion channel WDSV, Walleye
dermal sarcoma virus
75
Séquences en relation avec lapoptose
76
Quelques sites web intéressants
1) Généralités sur l apoptose http//users.rcn.
com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/T/TOC.html
voir  apoptosis  2) Fournisseurs Molecular
Probes sondes fluorescentes http//probes.invit
rogen.com/handbook/ Roche www.roche-applied-scie
nce.com voir  cell biology  puis
 apoptosis  Genentech www.researchApoptosis.
com Merck http//www.merckbiosciences.co.uk/htm
l/emd/ip_apoptosiskits.html
77
Notre adresse
Laboratoire de Cytométrie Unité Infectiologie
Animale Santé Publique (IASP-213) Centre de
Tourstél 02-47-42-77-59 Dominique Kerboeuf,
Yves Le Vern E-mail kerboeuf_at_tours.inra.fr
levern_at_tours.inra.fr Site web
http//www.tours.inra.fr/plates_formes/plate_for
me_d_analyses_cellulaires_et_moleculaires