Nincs diac

1
A Biotechnológiai Tanszék oktatási anyaga az
alábbi internet címen érheto el http//biotech.s
zbk.u-szeged.hu
2
(No Transcript)
3
(No Transcript)
4
(No Transcript)
5
A FEHÉRJÉK TÚLTERMELTETÉNEK ELONYEI   Fo
ok   Ha egy fehérjére nagy mennyiségben van
szükség, és a természetben csak kis mennyiségben
fordul elo, vagy az eredeti sejtvonal nehezen
kezelheto, belõle fehérje csak körülményesen
nyerheto.    KÖZVETLEN FELHASZNÁLÁS IPARI,
  proteázok, szénhidrátbontó enzimek,
lipázok, polimerázok,bioaktív peptidek, fehérjék,
hormonok, farmakológiai, gyógyászati
felhasználásra KUTATÁSI CÉLOKRA     biokémiai és
biofizikai vizsgálati módszerek, 3 dimenziós
röntgenszerkezet, mutációs analízis,
FELTÉTEL A felhasználás elott igazolni kell,
hogy az eredeti fehérje és a rekombináns
megfeleloje biológiailag ekvivalens
6
(No Transcript)
7
DNA
8
A DNS felépítése
9
DNS-olvadáspont
Streptococcus DNS olvadási görbéje.
Tm az a homérséklet ahol a 50 DNS megolvadt.
10
A DNS G-C tartalma és olvadáspontja közötti
összefüggés
11
Annealing vagy Hibridizáció

• Lehet
• DNS - DNS
• DNS - RNS
• RNS - RNS

12
DNS-struktúrák
A DNS
B DNS
Z DNS
13
(No Transcript)
14
(No Transcript)
15
DNS etanollal, izopropilalkohollal kicsapható
Kromoszómális DNS nagy, makroszkopikus molekula
kiemelheto   Minél nagyobb egy DNS, annál
könnyebben törik. Kb. 20 kb osnál nagyobb DNS
eros fizikai behatásnak(vortexes kevertetés) nem
teheto ki!  
Egyéb tisztítási módszerek   kromatográfia,
- ioncserés DEAE (dietil-aminoetil) kötés
alacsony, elúció magas sókoncentráció esetén A
DNS savas ? ionos kölcsönhatás
- szilikagél alapú elválasztás magas
sókoncentráció mellett felkötodik a DNS,
alacsony sókoncentrációnál eluálódik
16

- CsCl suruséggradiens centrifugálás adott
koncetrációjú CsCl oldat centrifugálás során
grádienst képez,a DNS a saját suruségének
megfelelo helyre vándorol és ott
megáll. különbözo konformációjú DNS-k
szétválaszthatóak, nagy tisztaság
RNS tisztítása RNS nagyon könnyen degradálódik,
RNázok stabilak a tisztítás során RNáz
mentesíteni kell mindent DEPC dietil
pirokarbonát
17
RNS tisztítása
sok eltéro protokol, ma univerzálisan
használható rendszer a guanidium
isotiocianát-fenol-kloroform oldattal történo
extrakció egy lépésben sejtfeltárás és
szerves-vizes folyadék fázisú extrakció.A vizes
fázis csak totál RNS-t tartalmaz ( és némi
kromoszómális DNS szennyezést, DNázI kezeléssel
eltávolítható
guanidin és izotiociánsav sója
18
mRNS tisztítás
eukarióták esetén stabil poliA farok
hordozó
TTTTTTTTTT-
magas só
alacsony só
19
DNS ELVÁLASZTÁSA ELEKTROFORÉZIS
denaturáló nem-denaturáló
lúgos, (DNS, agaróz) formaldehid, glioxál,
DMSO (RNS, agaróz) urea (DNS, akrilamid)
Nincs roncsoló ágens
méret gt 50 kb 100bp-50 kb lt 1000 bp
Mátrix agaróz agaróz 0.5- 2 poliakrilamid
technika pulzáló gélelektroforézis hagyományos
gélelektroforézis (5-20) hagyományos
LÁTHATÓVÁ TÉTEL etídium bromid, interkaláló
festék Þ nem-denturáló körülmények, elsosorban
duplaszálú DNS-t fest, de egyszálú nukleinsavakat
is. A DNS 254 nm-en elnyel Þ energia a festékre Þ
590 nm-en emisszió, a festék maga 302 és 366
nm-en nyel el Lehet gélbe rakni, utófesteni,
illetve a mintához adni. Érzékenység kb 10 ng


Egyéb festékek, fluoreszkáló anyagok pl.
fluoreszcein, minden körülmény között radioaktivit
ás minden körülmény között, 35S, 33P, 32P beta
sugárzók
.
20
Agaróz szerkezete
etidium bromid DNS
21
Horizontális gélelektroforézis
22
Géldokumentáció
23
(No Transcript)
24
Poliakrilamid gél futtató berendezés
25
Vertikális gélelektroforézis(PAGE)
26
DNS IZOLÁLÁSA GÉLBOL
- közös pont eloször elektroforetikus úton
elválasztjuk a DNS-t
- a megfelelo sávot kivágjuk steril pengével
AGARÓZ

• dialízis, dializáló hártyában, elektrodialízis
• a kapott DNS további tisztítása fenolos
  extrakcióval, alkoholos
• kicsapással, univerzális, széles mérettartomány

- fagyasztásos módszer a kivágott DNS-t
tartalmazó - agarózdarabot 80oC-on
megfagyasztjuk az agarós szerkezete roncsolódik,
ebbol a DNS egy szuron keresztül
centrifugálással kinyerheto további tisztítás
szükséges, univerzális
-

• kromatográfiás módszerek
• 6M NaI mellett a DNS 55oC-on (az agaróz megolvad)
  szilikagél felületére kötodik,
• a mátrix mosása után innen o55 C-on alacsony
  só(víz, TE) eluálható, majdnem univerzális,
  elég széles mérettartomány
• DEAE membránba futtatjuk a DNS-t,
• innen magassókoncentrációval (1.5M) magas
  homérsékleten eluálható
• nagy tisztaság, szuk, alacsony mérettartomány lt
  1.5 2 kb esetén
• jó a kitermelés

POLIAKRILAMID (PAGE) a kivágott darabot passzív
módon vagy elektromos térben eluáljuk majd
töményítjük, ioncserésen tisztítjuk
27
DNS/ RNS MÉRÉSE
A különbözo nukleotidoknak 260 nm körül eros
abszorbanciájuk van. Egyszálú DNS esetén
e(cm3/(µmol cm)
bázis
dA
15.4
dG
11.7
dC
7.5
dT
8.8
átlagosan e 10 (cm3/(µmol cm)
Ez leginkább oligonukleotidok esetén használatos.
Nagyobb egyszálú, kétszálú DNS-k, RNS-k esetén a
bázisok kölcsönhatásamiatt a számítás módosul
1 cm-es küvettában 260 nm-en 1.0 az
abszorbanciája 50 µg/ml kettosszálú DNS-t 33
µg/ml egyesszálú DNS-t 40 µg/ml egyesszálú
RNS-t tartalmazó oldatnak

A fehérjék 280 nm-en nyelnek el. Az A260nm/A280nm
arány a nukleinsav tisztaságára jellemzo
A260nm/A280nm ? 2 ? tiszta a preparátum A260nm/A2
80nm ? 1 - 1,5 ? sok a fehérje szennyezés

Egyéb módszerek fluoreszcein, kemilumineszcens
festékekkel. Érzékenyebb, de fluorimétert
igényel.
28
(No Transcript)