HPLC

1
HPLC MS

• A. Garnier
• 19 novembre 2014

2
Combinaison séparationdétection SDS-PAGE
Figure 1 SDS-PAGE of FBS depleted by different
matrices. 1) untreated FBS Cibacron blue albumin
depletion, flowthrough (FT, 2), eluate (E, 3)
MEP IgG depletion, FT (4), E (5) immuno-affinity
binding of the 12 most abundant human serum
proteins, FT(6), E(7) new method, FT (8), E (9).
Of all the tested methods, the new approach is
the most able to separate the abundant proteins
from the less abundant ones, to the point where a
number of the later are observable in the E
fraction (lane 9). This allow a far more
effective fractionation of FBS which in turn
allow a tremendous improvement in active
fraction(s) identification.
SDS-PAGE 4-12
A. Garnier lab result, Chem. Eng. dept,
Université Laval
3
Séparationdétection Électrophorèse 2-D
2-DE des protéines soluble de levures
(Échantillon de sérum sanguin, Gygi et al., 2000)
4
Séparation détection chromatographie
Chromatographie en phase gazeuse
Chromatographie sur papier buvard
5
Chromatographie gaz vs liquide
http//www.chem.agilent.com/Library/slidepresentat
ion/Public/HPLC20Separation20Fundamentals20-20
011409.pdf
6
Chromatographie en phase liquide à haute pression
(HPLC)

• Échange dions
• Tamis moléculaire
• Interaction hydrophobe
• Phase inverse
• Électrophorèse

• Automatique
• Réfrigéré

Échantilloneur
Réservoir de Phase mobile
Pompe
Colonne
Détecteur
Collecteur de fraction
Échantillon

• UV/visible
• Fluorescence
• Infra-rouge
• Indice de réfraction
• Conductivité
• Spectrométrie de masse

• En fonction
• de la colonne
• Gradient

7
Exemple de HPLC (Agilent 1100)
8
Différentes phases stationnaires
Phase mobile
Normale (hydrophobe)
Inverse (hydrophile)
Exclusion de taille
Ionique
P polaire
9
Exemple de chromatogramme
10
Caractéristique d'un pic chromatographique
Facteur de fixation k tR'/tM k (tR-tM)/tM k
tR/tM - 1 Efficacité N (tR/s)2 N 16
(tR/?)2
11
Résolution entre deux pics
Facteur de sélectivité a tB'/tA' kB/kA a
est constant pour des conditions
données Résolution RS ?t/?
Pic A
Pic B
tA
tB
?t
tM
?A
?B
Cliquer ici pour accéder au fichier Excel
12
Quantification en chromatographie
13
Spectroscopie de masse secteur magnétique

• Constitué de
• une source d'ionisation
• un ou plusieurs analyseurs qui séparent les ions
  produits selon leur rapport m/z
• un détecteur qui compte les ions et amplifie le
  signal
• un système informatique pour traiter le signal

14
Spectrométrie de masse - quadrupole

• m/z 10-4000
• Précision m/z 0.1-0.2
• Vitesse de balayage 5000 m/z par sec
• Le temps de vie dun ion de sa formation a sa
  détection 40-100 µs.

www.bris.ac.uk
15
Spectrométrie de masse trappe ionique

• Les ions sont capturés pour un certain intervalle
  de temps avant dêtre soumis à lanalyse par un
  MS
• Concentre les ions pour obtenir une détection
  significative
• Sensible, peu dispendieux, mais faible précision
  massique (Aebersold et Mann, 2003)

www.rzuser.uni-heidelberg.de/
16
Spectrométrie de masse - temps de vol (TOF)

• Les ions sont accélérés dans un champ électrique
  et acquièrent ainsi une vélocité dépendante de
  leur masse.
• La mesure du temps nécessaire à lion (temps de
  vol) ainsi accéléré pour parcourir la distance le
  séparant du détecteur permet den déduire la masse

17
Spectrométrie de masse résonance cyclotronique
dion (FT-ICR)

• En passant dans le champ B les ions subissent une
  mouvement circulaire perpendiculaire au champ B
• La force de rotation des ions est fonction de
  leur m/z
• Ils sont excités sur une orbite plus grande par
  induction dun courant RF
• La détection des ions est basée sur une trace de
  courant que lion laisse lors de son passage
  entre deux électrodes.
• La fréquence de ce courant est la même que celle
  du courant RF et lintensité du courant est
  proportionnel au nombre dions (Marshall et al.,
  1998)

http//www.chm.bris.ac.uk/ www.esi.umontreal.ca
18
Spectrométrie de masse résonance cyclotronique
dion (FT-ICR)

• Une fréquence peut être mesurée plus précisément
  que toutes autres lectures expérimentales
• Avec seulement 100 ions dun ratio m/z donné, le
  FT-ICR peut détecter un composé détection de
  protéine jusquà des seuils de 450 amol
  (10-18)(Marshall et al., 1998)
• Coûteux (gt 1M ) et volumineux
• Fichiers LC-MS requierent espace mémoire de
  plusieurs TB en mode continu

19
Chromatographie en phase gazeuse - spectroscopie
de masse (GCMS)
20
Spectroscopie de masse diagramme dapplication
21
Chromatographie en phase liquide - spectroscopie
de masse (LCMS)
22
Tout est dans l'interface LC-MS

• L'electro-atomisation (electro-spray ionisation,
  ESI)

John Fenn, prix Nobel de chimie, 2002
23
Tout est dans l'interface LC-MS

• L'electro-atomisation (electro-spray ionisation,
  ESI)

Stéphane Jacques, comédien dans "Mémoires vives"
24
Exemple danalyse myoglobine humaine

• AN P02144, séquence
• MGLSDGEWQLVLNVWGKVEADIPGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHL
  KSEDEMKASEDLKKHGATVLTALGGILKKKGHHEAEIKPLAQSHATKHKI
  PVKYLEFISECIIQVLQSKHPGDFGADAQGAMNKALELFRKDMASNYKEL
  GFQG
• 154 acides aminés
• MM 17184 Da
• R (Arg, pKa 12,1) 2
• K (Lys, pKa 10,6) 20
• H (His, pKa 6,0) 9
• E (glu, pKa 4,2) 14
• D (asp, pKa 3,7) 8

Informations obtenues sur UniProtKB
25
Exemple de résultat - myoglobine

• Myoglobine
• Le résultat obtenu est un spectre de masse
  représentant les rapports m/z des ions détectés
  sur l'abscisse et l'abondance relative de ces
  ions sur l'ordonnée
• Le spectre est le résultat de la distribution de
  charges sur la population moléculaire
• Permet d'analyser qualitativement et
  quantitativement la protéine d'intérêt
• ?MM 233 2 ac. aminés

26
Acides aminés

• La charge d'une protéine dans un LCMS sera à la
  fois fonction du voltage à l'interface et du pH
  de la phase mobile
• Le pH aura un effet sur la charge des acides
  aminés qui composent la protéine
• Le pKA des acides aminés sera affecté par la
  structure protéique
• Ce phénomène sera stochastique

"Amino Acids" by Dancojocari - http//commons.wiki
media.org/wiki/FileAmino_Acids.svgmediaviewer/Fi
leAmino_Acids.svg
27
Exemple de calcul de la distribution de charge

• Séquence AAAAHHHHAAAA
• On suppose un pKA commun 6 (pour His) à un pH
  6
• Chaque His a une probabilité de 50 d'être chargé

Cliquer ici pour accéder au fichier Excel
28
Exemple de résultat - myoglobine

• Myoglobine
• Le résultat obtenu est un spectre de masse
  représentant les rapports m/z des ions détectés
  sur l'abscisse et l'abondance relative de ces
  ions sur l'ordonnée
• Le spectre est le résultat de la distribution de
  charges sur la population moléculaire
• Permet d'analyser qualitativement et
  quantitativement la protéine d'intérêt
• ?MM 233 2 ac. aminés

Cliquer ici pour accéder au fichier Excel
Cliquer ici pour un exemple de calcul des pKA via
PROPKA
29
Exemple d'application de la LCMS pour le suivi
d'un bioréacteur
Image 2D "tR-m/z d'une production de virus
recombinant. Michaud et al., Appl Biochem
Biotechnol, 167474, 2012
30
Spectrométrie de masse en tandem (MSMS) analyse
de protéines
Dissociation nomenclature fragment proposée par
Roepstorff, 1984
(Yates, 1998 Westermeier et Naven, 2002 Graves,
2002)
31
Spectrométrie de Masse, Analyseurs Tandem MS
(MS/MS)

• MS/MS, 2 étapes 
• Détection et sélection dun composé
• Décomposition en fragments fournissant de
  linformation structurelle.
• Cette fragmentation est effectuée par "Collision
  Induced Dissociation" (CID).
• MS/MS, 2 types de configurations 
• Analyseurs en séries (tandem dans lespace)
• triples quadrupole, hybride quadrupole-TOF,
• Analyseurs employant les méthodes de trappes
  ionique (tandem en temps)
• quadrupole-trappe ionique (trappe ionique
  linéaire) ou directement un appareil de type
  FT-ICR (Westermeier et Naven, 2002).

32
Exemple d'analyse MSMS

• Albumine

BSA, numéro d'accès P02769 sur UniProt
MM 68kDa
Protéine majeure du sérum sanguin (20-30 g/L),
souvent utilisé en milieu de culture de cellules
de mammifères
33
MS de BSA
Michaud, Garnier, Lemieux, Duchesne, Proteomics,
9512, 2009
34
Exemple d'analyse MSMS

• Albumine

gtP02769ALBU_BOVIN Serum albumin - Bos taurus
(Bovine). MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGE
EHFKGLVLIAFSQYLQQCPF DEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKS
LHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEP
ERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHP
YFYAPELLYY ANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQ
RLRCASIQKFGERALKAWSVA RLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKEC
CHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKE
CCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFL
GSFLYEYSRR HPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDK
LKHLVDEPQNLIKQNCDQFEK LGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE
VSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLIL
NRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLF
TFHADICTLP DTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVD
KCCAADDKEACFAVEGPKLVV STQTALA
Number of amino acids 594 Molecular weight
68026.9 Theoretical pI 5.77
Informations obtenues sur Expasy, outil
PeptideMass http//web.expasy.org/peptide_mass/
35
Albumine fragments trypsiques
position mass peptide sequence position mass peptide sequence
25-28 500,2463 DTHK 300-309 1177,5591 ECCDKPLLEK
29-34 712,3736 SEIAHR 310-318 1015,4877 SHCIAEVEK
37-44 974,4577 DLGEEHFK 319-336 1955,9596 DAIPENLPPLTADFAEDK
45-65 2435,2427 GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK 341-346 752,3573 NYQEAK
66-75 1163,6306 LVNELTEFAK 347-359 1567,7427 DAFLGSFLYEYSR
76-88 1349,546 TCVADESHAGCEK 361-371 1283,7106 HPEYAVSVLLR
89-100 1362,6722 SLHTLFGDELCK 375-386 1388,5708 EYEATLEECCAK
101-105 545,3405 VASLR 387-399 1497,6314 DDPHACYSTVFDK
106-117 1364,4803 ETYGDMADCCEK 402-412 1305,7161 HLVDEPQNLIK
118-122 658,3155 QEPER 413-420 1011,42 QNCDQFEK
123-130 977,4509 NECFLSHK 421-433 1479,7954 LGEYGFQNALIVR
131-138 886,4152 DDSPDLPK 438-451 1511,8427 VPQVSTPTLVEVSR
139-151 1519,7461 LKPDPNTLCDEFK 460-468 1052,4499 CCTKPESER
157-160 537,282 FWGK 469-482 1667,8131 MPCTEDYLSLILNR
161-167 927,4934 YLYEIAR 483-489 841,46 LCVLHEK
169-183 1888,9268 HPYFYAPELLYYANK 490-495 660,3563 TPVSEK
184-197 1633,6621 YNGVFQECCQAEDK 499-507 1024,455 CCTESLVNR
198-204 701,4014 GACLLPK 508-523 1823,8996 RPCFSALTPDETYVPK
205-209 649,3338 IETMR 524-528 609,2878 AFDEK
212-218 703,4097 VLASSAR 529-544 1850,8993 LFTFHADICTLPDTEK
223-228 649,3338 CASIQK 549-557 1014,6193 QTALVELLK
229-232 508,2514 FGER 558-561 509,3194 HKPK
236-241 689,3729 AWSVAR 562-568 818,4254 ATEEQLK
249-256 922,488 AEFVEVTK 569-580 1399,6926 TVMENFVAFVDK
257-263 789,4716 LVTDLTK 581-587 725,2593 CCAADDK
267-280 1578,5981 ECCHGDLLECADDR 588-597 1050,4924 EACFAVEGPK
281-285 517,298 ADLAK 598-607 1002,583 LVVSTQTALA
286-297 1386,6206 YICDNQDTISSK      
36
Analyse LC et MS1 de l'albumine trypsique
Pour en savoir plus, suivez ce lien (cliquer ici)
37
Spectrométrie de Masse - quantification

• Un problème majeur lors de lanalyse de peptide
  et/ou protéines en MS est la variation
  dionisation due à des paramètres non
  contrôlable.
• Lintensité du signal dun peptide ne reflète pas
  directement la quantité de ce peptide (Lu et al.,
  2004)
• Solution implémentation dun standard interne
  un isotope stable

38
Spectrométrie de Masse - ICAT

• Isotope coded affinity tagging (ICAT)
• Réactif sous 2 formes réagissant avec les
  groupements thiol des cystéines des protéines
  permettant davoir un groupement disotopes sur
  les peptides
• Différence de 8 unités de masse entre
  léchantillon vs un standard (Gygi et al., 1999)

(Graves, 2002)
39
Spectrométrie de Masse - quantification autres
méthodes

• ICAT réactif coûteux (25 /nmol)
• Se lie seulement aux cystéines des peptides
  (Goshe et Smith, 2003)
• SILAC stable isotope labeling by amino acids in
  cell culture (0.2 /nmol) (Ong et al., 2002)
• Autres méthodes iTRAQ et AQUA

40
Protéomique du sérum sanguin

• 60 à 80 g/L de protéine (Tirumalai et al., 2003)
• 10 000 protéines différentes
• 22 protéines 99 de la quantité protéinique du
  sérum (Zhang et al., 2005)
• 12 log de variation de concentration (Anderson et
  Anderson, 2002 Zhang et al., 2005)

Tirumalai et al., 2003
41
Protéomique du sérum sanguin
Anderson et Anderson, 2002