DNA reparatsioon. DNA kahjustuste allikad.

1
DNA reparatsioon. DNA kahjustuste allikad.
DNA-d kahjustatakse pidevalt nii rakusiseste
protsesside kui ka välistegurite poolt.
Hinnanguliselt toimub inimese igas rakus iga päev
10000 kuni 1000000 DNA kahjustamise sündmust, mis
üldjuhul kõik ära parandatakse. Peamised DNA
kahjustuste põhjustajd on Oksütatiivne stress.
Seda põhjustavad keemiliselt aktiivsed ja
ebastabiilsed hapnikuühendid (ROS - reactive
oxygen species), mis tekivad erinevate
metaboolste protsesside vaheproduktidena.
Üldiselt on rakkudes süsteemid, mille ülesandeks
on nende vaheühendite lagundamine ja
neutraliseerimine, aga sellele vaatamata pääsevad
mõned DNA-d kahjustama. ROS-id võivad oksüdeerida
DNA aluseid tekitada näiteks 8-oksü-7,8-dihüdrogu
aniini (8-oxoG) või siis põhjustada üheahelalisi
katkeid DNA-s. UV kiirgus, mis põhjustab
ristsidemeid (crosslinks) DNA ahelas
kõrvutiasetsevate pürimidiinide vahel. Selle
tulemusks on 6-4 fotoproduktide (6-4 PP 6-4
photoproduct) ja CPD (cyclobutane pyrimidine
dimer) teke. CPD-st esineb kõige sagedamini T-T
dimeere.
2
(No Transcript)
3
DNA reparatsioon. DNA kahjustuste allikad.
Ioniseeriv kiirgus (näiteks g-kiirgus) põhjustab
DNA kaheahelalisi katkeid. Ainuüksi loodusliku
radioaktiivsuse fooni tõttu saab meie keha iga
päev umbes 200 miljonit korda kiiritada. DNA
aluste hüdrolüüs ja kõrgendatud temperatuur
viivad DNA aluste eemaldamiseni (depurination,
depyrimidination) või nende keemiliste omaduste
muutuseni (deamination). Kokkupuutumine erinevate
kemikaalidega, mis modifitseerivad nukleotiide
või seonduvad DNA-ga ning indutseerivad katkeid
või ristsidemeid DNA ahelates. Siia kuuluvad ka
paljud (vähi)ravimid. Vead DNA replikatsioonis.
Kõik DNA polümeraasid teevad vigu, mille nad küll
tavaliselt ise ära parandavad, kuid osad jäävad
need siiski alles ning tekitavad olukorra, kus
DNA erinevatel ahelatel on omavahel
mittepaarduvad nukleotiidid.
4
DNA reparatsioonisüsteemid.
DNA-d vigastuste eemaldamiseks on rakkudes olemas
mitmeid erinevaid reparatsioonisüsteeme, mis on
võimelised üksteist osaliselt asendama. Otsesed
pöördreaktsioonid (direct reversal) on väga
kitsalt spetsialiseerunud mõnede konkreetsete
kahjustuste eemaldamiseks. Näiteks saab T-T
dimeere (ja ka teisi CPD-e ning 6-4 fotoprodukte)
parandada spetsiaalsete ensüümide, fotolüaaside,
abiga. Fotolüaas parandab UV kiirgusest
põhjustatud vigastusi ning ensüüm ise vajab oma
tööks (nähtava) valguse energiat. Fotolüaasi on
leitud bakteritest, pärmidest, Drosophilast,
Xenopusest, kuid mitte imetajatest. Samuti on
võimalik otsese pöördreaktsiooniga parandada
näiteks guaniinialuste metüleerimist. Seda
tehakse metüülguaniini metüültransferaasi abiga,
kuid selle reaktsiooni tulemusena valk
inaktiveerub, seega saab ühe metüülguaniini
metüültransferaasiga parandada ühe
metüülguaniini. O6-metüülguaniin on aga väga
ohtlik modifikatsioon, kuna selline nukleotiid
võib edukalt paarduda nii C kui T nukleotiidiga,
mistõttu selline metüleerumine ei tekita DNA
ahelas erilist probleemi, kuid replikatsiooni
käigus lülitab DNA polümeraas vastasahelasse T
ning sellega ongi tekitatud mutatsioon.
5
Fotolüaas
Miks imetajatel pole fotolüaasi? Võimalik, et see
läks evolutsiooni käigus kaotsi ajal, kui
dinosaurused valitsesid maailma. Imetajad olid
siis juba olemas, aga nad olid pisikesed
tähtsusetud öise eluviisiga olevused, kes
päikesevalguse kätte sattusid harva...
6
DNA reparatsioonisüsteemid.
DNA ühel ahelal olevate vigastuste parandamiseks
on kolm peamist süsteemi Base excision repair
(BER), mille käigus eemaldatakse DNA ahelast
üksik kahjustatud nukleotiid mis asendatakse
uuega. BER-i kasutatakse peamiselt oksüdeeritud,
alküleeritud, hüdrolüüsitud ja deamineeritud
nukleotiidide väljavahetamiseks. Nucleotide
excision repair (NER), mille käigus asendatakse
DNA kahjustuse ümbrusest umbes 30 nukleotiidi
pikkune üheahelaline DNA lõik. NER tunneb ära
vigastusi, mis tekitavad suuremaid muudatusi DNA
üldises struktuuris. Sellisteks on näiteks
tümiini dimeerid ja DNA üheahelalised katked. NER
jaotub kaheks alaliigiks 1) transcription-coupled
repair (TCR), mis aktiveerub, kui RNA polümeraas
avastab DNA kahjustuse ning jääb seetõttu
transkribeeritavale alale seisma. TCR tagab
transkribeeritava DNA ahela kiire parandamise. 2)
global genome repair (GGR), mis toimub
transkriptsioonist sõltumatult ning on mõnevõrra
aeglasem kui TCR. GGR parandab ka näiteks
vigastusi transkribeeritava geeni mittekodeerivas
DNA ahelas. Mismatch repair (MMR) kõrvaldab
vigastused, mis on tekkinud DNA replikatsiooni
või rekombinatsiooni käigus. Nendel juhtudel pole
kumbki DNA ahel otseselt vigane, kuid nad ei
paardu omavahel.
7
DNA reparatsioonisüsteemid.
DNA kaheahelalisi katkeid parandatake kahel
erineval viisil Mitte-homoloogne DNA otsade
ühendamine - NHEJ (non-homologous end joining),
mille käigus DNA ligaas ühendab katkenud ahelad.
NHEJ võib olla suhteliselt korrektne juhul, kui
katkenud DNA ahelate otsad omavad kasvõi lühikest
üheahelalist homoloogiat (mis saab tekkida siis,
kui mõlemad ahelad ei katke täpselt samast
kohast). Reeglina aga tekitab NHEJ mutatsioone,
eriti väiksemate DNA lõikude deletsioone. Raku
seisukohalt on see siiski parem variant kui jätta
DNA ahelate otsad üldse ühendamata. Homoloogne
rekombinatsioon HR (homologous recombination)
on parim viis kaheahelaliste katkete
parandamiseks. HR-i puhul taastatakse katkenud
koht homoloogse kromosoomi või tütarkromatiidi
abil puuduv DNA osa kopeeritakse vigastamata
kromosoomi pealt. HR-i puhul taastatakse
vigastatud koht täielikult ja ilma
mutatsioonideta. HR on oluline reparatsioonisüstee
m rakutsükli S ja G2 faasis, kuid G1 faasis
toimub sagedamini NHEJ.
8
DNA reparatsioonisüsteemid.
9
Base excision repair (BER)
BER-i esimeses etapis toimub vigastuse
äratundmine erinevate DNA glükosülaaside poolt
ning vigastatud nukleotiidi aluse äralõikamine.
Selle tulemusena jääb DNA ahelasse ilma ühegi
alusjäägita nukleotiid (abasic site). Järgmine
etapp on DNA ahela lõikamine tühja nukleotiidi
juurest APE1 endonukleaasi poolt.
10
Base excision repair (BER)
Edasi võib asi minna kas mööda pikka või lühikest
rada. Lühikeses variandis järgneb tekkinud
ühenukleotiidise augu täitmine DNA polümeraas b
poolt, millele järgneb DNA otste ligeerimine
ligaas III poolt. Pikas variandis sünteesitakse
2-6 nukleotiidi ulatuses uut DNA-d, vana DNA
üleliigne osa lõigatakse ära FEN1 endonukleaasi
poolt ning DNA ligeeritakse ligaas I poolt
11
Nucleotide excision repair (NER)
NER jaotub kaheks GGR ja TCR, erinevus seisneb
selles kuidas DNA vigastus avastatakse. TCR puhul
on oluline RNA polümeraas II ja tema
elongatsioonifaktor CSB. GGR puhul tuntakse DNA
vigastus ära XPE (DDB2) ning XPC-hHR23B
valgukompleksi poolt.
12
Nucleotide excision repair (NER)
Järgmiseks etapiks nii GGR kui ka TCR rajas on
TFIIH kohaletoomine. TFIIH on muuhulgas ka DNA
helikaas (subühikud XPB ja XPD) ning nende abil
toimub vigastatud kohas DNA ahelate
avamine. Sellist avatud kompleksi
stabiliseerivad XPA (kontrollib, kas tegu on ikka
DNA kahjustusega) ja RPA (seondub üheahelalise
DNA-ga). Kui XPA ei seondu, siis NER-i rada edasi
ei lähe. Järgneb umbes 30 nukleotiidi pikkuse
DNA tüki väljalõikamine endonukleaaside XPG ja
XPF-ERCC1 poolt. Tekkinud auk sünteesitakse
täis DNA polümeraaside d ja e poolt, vajalikud on
ka RPA, RPC ja PCNA. TCR-i puhul seonduvad
seisma jäänud RNA polümeraasiga CSB ning
CSA-Cul4A-CSN kompleks. Need faktorid on olulised
TFIIH kohaletoomiseks ning lisaks on
CSA-Cul4A-CSN kompleks vajalik võimalikuks RNA
polümeraasi lagundamiseks. CSB on ka RNA
polümeraasi elongatsioonifaktor ning algatuseks
püüab ta aidata seisma jäänud polümeraasil
transkriptsiooni jätkata. Kui see ei õnnestu,
siis aktiveeritakse TCR.
13
(No Transcript)
14
Mismatch repair (MMR)
MMR on vajalik DNA replikatsioonil tekkinud
mittepaarduvate aluspaaride korrigeerimiseks. MMR
parandab DNA polümeraasi vead ning tõstab
replikatsiooni täpsust 100-1000 korda. DNA
paardumise vigu otsivad hMSH2/6 ja hMSH2/3
valgukompleksid (human MutS homolog). Leidnud
vea, moodustavad hMSH2/6 valgud suletud
kompleksi, neile seonduvad omakorda hMLH1 ja
hPMS2. See kompleks hakkab mööda DNA-d edasi
liikuma kuni jõuab järele DNA polümeraasile,
eemaldab selle DNA-lt ning toob kohale
eksonukleaas I (Exo I), mis lagundab sünteesitud
ahela valesti paardunud kohani. Ilma
abifaktoriteta on Exo I 5-gt3 nukleaas, kuid
koos PCNA ja RFC-ga muutub ta 3-gt5
eksonukleaasiks. Jõudnud valesti paardunud
kohani, alustatakse uuesti DNA sünteesi.
15
NHEJ (non-homologous end joining)
NHEJ on levinud DNA reparatsioonisüsteem
kõrgemates eukarüootides. See süsteem on küll
kõikidest võimalikest kõige ebatäpsem ja
põhjustab tavaliselt lühikesi deletsioone, kuid
üldjuhul on see parim mida teha saab. DNA
reparatsioon homoloogse rekombinatsiooni abil
toimub põhiliselt S ja G2 faasis kui
tütarkromatiidid on füüsiliselt üksteise lähedal
ning seetõttu pole homoloogse ala leidmine
keeruline. Põhimõtteliselt oleks HR teostamine
võimalik ka G1 faasis kasutades homoloogset
kromosoomi, kuid ruumiliselt võivad need paikneda
väga erinevates piirkondades. Lisaks moodustavad
erinevad kordusjärjestused näiteks inimese
genoomist umbes 40, mistõttu homoloogse
kromosoomi identifitseerimine võib olla väga
keeruline. Kordusjärjestuste olemasolu ongi
peamine, kui mitte ainus, oluline põhjus miks
rakud parandavad kaheahelalisi DNA katkeid NHEJ
abil, riskides seejuures geneetilise info
muutumisega. NHEJ toimumiseks on vajalik, et
katkenud DNA otsad oleksid üksteise lähedal,
kuigi pole teada, kuidas see saavutatakse (seda
võivad teha nukleosoomid). Katkenud DNA otsi
tunneb ära kahest valgust koosnev kompleks Ku. Ku
subühikuteks on Ku70 ja Ku80 (mida tuntakse ka
nime all Ku86 ja mille tegelik molekulmass on
hoopis 83 kD). Ku kompleksi sees on auk,
millesse mahub täpselt dsDNA. Kui Ku panna DNA
rõngasmolekuli peale, siis ta ei saa sealt enam
kunagi maha.
16
NHEJ (non-homologous end joining)
Järgmisena seondub DNA otstega DNA-PK (DNA sõltuv
proteiinkinaas). Ku on selle interaktsiooni
soodustaja, kuigi DNA-PK seonduks DNA otsega ka
ilma Ku abita. DNA-PK ja Ku interaktsioonid
võivad samuti hoida katkenud DNA otsi üksteise
ligidal. DNA-PK fosforüleerib mitmeid
reparatsiooniks vajalikke valke, sealjuures
iseennast. DNA-PK soendub ka nukleaasiga ARTEMIS
(pärmis MRX kompleks), mis on vajalik DNA otstest
mõnede nukleotiidide eemaldamiseks ning DNA
otstes lokaalse homoloogia leidmiseks. Samuti
seondub DNA-PK-Ku XRCC4-ligaas IV kompleksiga,
mis ühendab vabad DNA otsad.
17
Homologous recombination (HR)
DNA reparatsioon homoloogse rekombinatsiooni abil
tagab korrektse dsDNA katkete parandamise. Selle
käigus ei lähe midagi kaotsi, kuid võib toimuda
cross-over tütarkromatiidide vahel. DNA
katkestus tuntakse ära MRX (Mre11-Rad50-Nbc1)
kompleksi poolt, mis on nukleaas ning lagundab
ühe DNA ahela nii, et jääb alles 3 otsaga
üheahelaline DNA. Sellega seonduvad RPA, Rad51
ja Rad52. Vaba 3 ots kaetakse Rad51 valkudega
ning selline ssDNA-Rad51 filament hakkab otsima
homoloogset dsDNA-d vigastamata
kromatiidil. Järgneb ahela invasioon ning
hübriid-DNA moodustamine. Selleks on vaja veel
terve hulk Rad valke (Rad54, 57, 59 pärmis ning
BRCA1, BRCA2, XRCC2 ja XRCC3 imetajates). Siis
toimub puuduvate lõikude süntees ning DNA otste
ligeerimine ning lõpuks tuleb kromatiidid taas
lahutada.
18
Holliday junction
Holliday ühendusi võib lahti lõigata kahel
viisil, ühel juhul toimub cross-over, teisel
juhul mitte.
19
DNA reparatsiooniga seotud haigused
Xeroderma pigmentosum on geneetiline haigus,
mille puhul esinevad mutatsioonid NER-iks
vajalikes geenides. Selle tulemusena ei suuda
rakud eemaldada peamiselt UV kiirgusest
tulenevaid DNA vigastusi. XP patsiendid on
ülitundlikud UV kiirguse suhtes, päikesepaiste
põhjustab tõsiseid põletusi ning sellisetel
inimestel on väga suur soodumus nahavähi
tekkeks. Cockayne sündroomi patsientidel on
defektne TCR rada, mutatsioonid on geenides CSA
või CSB. Haigust iseloomustavad närvisüsteemi
alaareng, UV tundlikus ning kiire vananemine.
Tay sündroomi (trichothiodystrophy)
iseloomustavad naha, küünte ja juuste
ebanormaalne areng, vaimne ja füüsiline alaareng.
20
DNA reparatsiooniga seotud haigused
Werneri sündroomi iseloomustab kiire vananemine.
WS on haruldane haigus ning on levinud peamiselt
Jaapanis. Selle haigusega inimesed kasvavad ja
arenevad normaalselt kuni puberteedieani, kuid
peale seda algab kiire vananemine. Enamsti ei ela
WS patsiendid vanemaks kui 40-50 aastat, surres
tavaliselt vähki või südmehaigustesse. Haigust
põhjustab mutatsioon WRN geenis, mis on
tõenäoliselt vajalik Holliday ühenduste
avamiseks. Ataxia telangiectasia on haruldane
neurodegeneratiivne haigus mida iseloomustavad
näiteks kõndimishäired. AT patsientidel on kõrge
soodumus vähkkasvajate tekkeks ning nende eluiga
ei ületa reeglina 20 aastat. Haigust põhjustab
mutatsioon geenis ATM, mis on oluline dsDNA
katkete äratundmises ning rakutsükli
kontrollimisel DNA katkete korral.
21
(No Transcript)