R N A

1
R N A

• Falten Finden

2
Übersicht

• RNA falten
• Sekundärstrukturen und Funktion
• Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence
• Grundidee
• Vorgehen Schritt 1
• Vorgehen Schritt 2
• Beispiele
• Leptomonas collosoma
• Bakteriophage ?
• Auswertung
• Probability Profiling
• Accessibility Plots
• Samplegröße
• Sfold
• RNA finden

3
Übersicht

• RNA falten
• Sekundärstrukturen und Funktion
• Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence
• Grundidee
• Vorgehen Schritt 1
• Vorgehen Schritt 2
• Beispiele
• Leptomonas collosoma
• Bakteriophage ?
• Auswertung
• Probability Profiling
• Accessibility Plots
• Samplegröße
• Sfold
• RNA finden

4
Sekundärstrukturen und deren Funktion

• Ständig wiederkehrende Motive in RNA-Struktur
  erkennbar
• RNA besteht hauptsächlich aus Kombinationen
  dieser Motive
• Achtung keine Pseudoknoten berücksichtigt

5
Sekundärstrukturen und deren Funktion

• RNA-Sekundärstrukturen wichtig für
• Katalyse (Ribozyme)
• RNA-Splicing
• Regulation der Translation
• Interaktionen zwischen Nucleinsäuren
• Sekundärstrukturen bestimmen auch die
  Tertiärstruktur
• ? korrekte Sekundärstruktur wichtig für korrekte
  Tertiärstruktur
• ? korrekte Sekundärstruktur wichtig für korrekte
  Funktion
• Strukturbestimmung experimentell schwierig
• Besonders für langkettige Nucleinsäuren
• ? rechnergestützte Strukturvorhersage extrem
  wichtig

6
Übersicht

• RNA falten
• Sekundärstrukturen und Funktion
• Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence
• Grundidee
• Vorgehen Schritt 1
• Vorgehen Schritt 2
• Beispiele
• Leptomonas collosoma
• Bakteriophage ?
• Auswertung
• Probability Profiling
• Accessibility Plots
• Samplegröße
• Sfold
• RNA finden

7
Algorithmus - Grundidee

• Annahme Faltung nur in bestimmte
  Sekundärstrukturelemente
• Ansatz verfolgt Minimierung der freien Energie
• Energie (U)
• Nimmt ab, wenn z.B. Bindungen ausgebildet werden
• Entropie (S)
• Maß für die Unordnung eines Systems
• Nimmt nach 2. Hauptsatz der Thermodynamik zu
• Freie Energie (Helmholtz Energie, F) F U TS
• Setzt Entropie und Energie in Beziehung

8
Algorithmus - Grundidee

• Algorithmus arbeitet in 2 Schritten
• Schritt 1
• Untersucht bildbare Sekundärstrukturen der
  Sequenz (und ihre freie Energie)
• Errechnet Zustandssummen für Teilsequenzen
• Schritt 2
• Errechnet mit Zustandssummen Gibbs-Boltzmann-Verte
  ilung (Ws) der Strukturen
• Wählt zufällige Kombination von
  Sekundärstrukturen aus

1)
2)

--______------_----_--_-_----
Teilergebnisse
Sammlung von Basenpaaren
Sekundärstruktur
9
Algorithmus - Grundidee - Probleme

• freien Energie für Sekundärstrukturen nur
  approximiert
• ? durch Änderungen andere Faltungen
  wahrscheinlicher
• Tertiärstruktur (und Effekte) unberücksichtigt
• Struktur mit minimaler freier Energie (MFE) muss
  nicht die reale sein
• ? Realität suboptimal
• Aber Algorithmus sucht nicht unbedingt die
  wahrscheinlichsten Teilstrukturen aus

10
Übersicht

• RNA falten
• Sekundärstrukturen und Funktion
• Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence
• Grundidee
• Vorgehen Schritt 1
• Vorgehen Schritt 2
• Beispiele
• Leptomonas collosoma
• Bakteriophage ?
• Auswertung
• Probability Profiling
• Accessibility Plots
• Samplegröße
• Sfold
• RNA finden

11
Algorithmus Vorgehen (I)

• Berechnen der Boltzmann-Statistik
  (Gibbs-Boltzmann-Verteilung) einer
• Sekundärstruktur I
• für eine gegebene Sequenz S
• nach
• E(S, I) freie Energie der Sekundärstruktur für
  diese Sequenz
• R Gaskonstante
• U Zustandssumme aller zulässigen
  Sekundärstrukturen für S
• Bedeutung Wahrscheinlichkeit einer bestimmten
  Sekundärstruktur für eine gegebene Sequenz unter
  Berücksichtigung aller möglichen
  Sekundärstrukturen

12
Algorithmus Vorgehen (I) Defs.
Rij
3
5
.. ..
1 i
.. j n

• n Anzahl an Ribonukleotiden
• Rij Teilsequenz von Nukleotid i bis Nukleotid
  j 1 i,j n
• rk Nukleotid an Position k, rk ?A, C, G, U
  i k j
• Iij Sekundärstruktur für Rij, ri und rj paaren
  eventuell
• IPij Sekundärstruktur für Rij, ri und rj paaren
  miteinander

13
Algorithmus Vorgehen (I)
Benötigt in
Erinnerung
Teilsequenz

• Zustandssummen für Rij
• mit Sekundärstruktur Iij
• mit Sekundärstruktur IPij
• (i und j gepaart)
• E(Rij, x) freie Energie der Sekundärstruktur x
  für Rij
• R Gaskonstante
• T 310,15 K
• Rekursive Berechnung durch Algo vom McCaskill

Sek.-Strt.
Sek.-Strt.
14
Algorithmus Vorgehen (I)

• Berechnung der u(i, j) bzw. up(i, j)..
• Mit u(1, n) kann Boltzmann-Verteilung (Ws) einer
  I1n für R1n berechnet werden

Sek.-Strt.
S (Gesamtsequenz)
Genutzt in Schritt 2
15
Übersicht

• RNA falten
• Sekundärstrukturen und Funktion
• Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence
• Grundidee
• Vorgehen Schritt 1
• Vorgehen Schritt 2
• Beispiele
• Leptomonas collosoma
• Bakteriophage ?
• Auswertung
• Probability Profiling
• Accessibility Plots
• Samplegröße
• Sfold
• RNA finden

16
Algorithmus Vorgehen (II)
Rij
3
5
.. ..
1 i
.. j n

• Rij kann 5 verschiedene Zustände annehmen

17
Algorithmus Vorgehen (II) nötige Variablen(1)

• Ws, eine dieser 5 Möglichkeiten zu wählen
  (unbekannt, ob ri und rj paaren)

Strafe für Paarung AC bzw. GU
freie Energie für dangling 5
freie Energie für dangling 3
Array mit zuvor berechneten Variablen
Zuerst h variieren, dann zu den Positionen von h
l verändern
18
Algorithmus Vorgehen (II) nötige Variablen(2)

• Bekannt, dass ri und rj paaren ? Ws für die 5
  möglichen Strukturen

freie Energie eines Hairpin geschlossen von ri
und rj
freie Energie des Stacking-Bp ri und rj
freie Energie eines Bulge bzw. Interior Loop
Möglichkeiten, zwischen h und l einen Bulge bzw.
Interior Loop zu sampeln
19
Algorithmus Vorgehen (II)

• Sampeln
• berechne die Struktur-Ws für Rij (mit den u(i,j)
  aus Schritt 1)
• wähle über eine Zufallsvariable gemäß den
  berechneten Wahrscheinlichkeiten eine Möglichkeit
• Benutzt zwei Stacks
• A verwaltet Tupel (i, j, I) (noch zu faltendes
  Teilstück)
• Sequenz von Nukleotid i bis j
• I 1 Nukeotid i und j bilden eine Bindung aus
  I 0 unbekannt, ob i und j paaren
• B
• Wird durch Algorithmus gefüllt
• sammelt Basenpaare und ungepaarte Basen
• ? enthält nötige Informationen für
  Sekundärstruktur
• Startzustand
• A enthält (1, n, 0)

0
1
20
Algorithmus Vorgehen (II)
Erinnerung
A ungefaltete Bereiche
B Bindungsbeziehungen
I 0

• 1) Start mit R1n (also (1, n, 0) auf Stack A),
  Paarung nicht bekannt? bilde die P0, Pij,
  Phi, Pil, Ps1h für i 1, j n wähle eine
  Möglichkeit
• Mögliche Ergebnisse

Keine Paarung, füge ungepaarte Basen von 1 bis n
in Stack B ein
(1, n, 1) in Stack A einfügen
(h, n, 1) in Stack A einfügen ungepaarte Basen 1
bis (h-1) in Stack B einfügen
(1, l, 1) (l1, n, 0) in Stack A einfügen
(h, l, 1) (l1, n, 0) in Stack A
einfügen Ungepaarte Basen von 1 bis (h-1) in
Stack B einfügen
21
Algorithmus Vorgehen (II)
Erinnerung
A ungefaltete Bereiche
B Bindungsbeziehungen
2) Nimm nächstes Tupel (i, j, I) für Rij von
Stack A a) I 0 verfahre wie im letzten
Schritt berechne die P-- b) I 1 i und j
paaren, betrachte die QijH, QijS, QijBI, QijM
Füge die ungepaarten Basen in Stack B ein Füge das schließende Basenpaar in Stack B ein Nimm neues Tupel von Stack A
Füge das Basenpaar ij in Stack B ein Füge (i1, j-1, 1) in Stack A ein Nimm neues Tupel von Stack A
Berechne die QhlBI, i lt h,l, lt j Füge Basenpaar ij und ungepaarte Basen des Loops in Stack B ein Füge (h, l, 1) in Stack A ein Nimm neues Tupel von Stack A
22
Algorithmus Vorgehen (II)
1) Sampel das erste innere Basenpaar (bilde
die P--, wähle Möglichkeit, verfahre entsprechend)
.. ..
2) Sampel das nächste Basenpaar
.. ..
3) Wiederhole 2, bis alle abgearbeitet Nimm neues
Tupel von Stack A
23
Algorithmus Vorgehen(II)
Stack A
Stack B
Für jedes Basenpaar innerhalb des MB-Loop

• Sampling im Überblick

Schritt 1 nimm (i, j, I) von A
Stack A leer?
I 0
Sampel Basenpaar
Möglichkeiten der Paarbildung bestimmt
I 1
Sampel Loop
Struktur bestimmt, zu der Basenpaar zugehörig ist
24
Algorithmus Vorgehen(II)

• Samling-Schritt arbeitet, bis Stack A leer ist
• Stack B enthält Angaben über Paarungen der n
  Basen in R1n
• ? 1 Sekundärstruktur
• Wahrscheinlichkeit eines Struktur nimmt
  exponentiell mit wachsender freier Energie ab
  (bedingt durch Boltzmann-Verteilung)
• Mit hoher Wahrscheinlichkeit optimale MFE
• Mit relativ hoher Wahrscheinlichkeit gute
  (suboptimale) MFE
• Mit geringer Wahrscheinlichkeit schlechte MFE
• Sinnvoll Sampling-Schritt mehrfach ablaufen
  lassen
• ? statistisch repräsentatives Ergebnis
• Konsensus-Struktur

25
Übersicht

• RNA falten
• Sekundärstrukturen und Funktion
• Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence
• Grundidee
• Vorgehen Schritt 1
• Vorgehen Schritt 2
• Beispiele
• Leptomonas collosoma
• Bakteriophage ?
• Auswertung
• Probability Profiling
• Accessibility Plots
• Samplegröße
• Sfold
• RNA finden

26
Beispiele Leptomonas collosoma

• Faltung der spliced leader RNA (SL RNA) von L.
  collosoma
• 56 nt lang
• 2 Sekundärstrukturen identifiziert (Funktion
  unbekannt)
• Vorgehen
• Mit Schritt 1 die Ws der Substrukturen berechnet
• 1000 mal gesampelt
• Entstandene Sekundärstrukturen verglichen
• Ergebnis
• 2 generelle Klassen
• Klasse 1 mit 3 Unterklassen (A, B, C)
• Klasse 2 mit 2 Unterklassen (A, B)

27
Beispiele Leptomonas collosoma

• Klasse 1 Alle Unterklassen mit 2 identischen
  Helices
• 1
• 2

Weitere 2 Helices gemeinsam
Unterschied in Hairpin
Quadratgröße Häufigkeit der Basenpaare in
Samples
mfold(3.1)-Struktur ? MFE-Struktur
28
Beispiele Leptomonas collosoma

• Klasse 2 Unterklassen erneut mit 2 identischen
  Helices
• Unterklasse B mit zusätzlichem Stem am 5-Ende

Quadratgröße Häufigkeit der Basenpaare in
Samples
29
Beispiele Leptomonas collosoma

• Repräsentanten der Klasse 1

identisch
mfold(3.1)-Struktur ? MFE-Struktur
Bis auf Fehlen der kurzen Helix mit
mfold-Struktur identisch
Experimentell bestimmte Faltungsart 1
30
Beispiele Leptomonas collosoma

• Repräsentanten der Klasse 2

identisch
Experimentell bestimmte Faltungsart 2
31
Beispiele Leptomonas collosoma

• Gesamtübersicht Häufigkeiten der Klassen und
  deren Repräsentanten

• Tatsächliche Faltungsart 1

• mfold-Struktur (MFE)

• Leicht veränderte mfold-Struktur (suboptimale
  MFE)

• Tatsächliche Faltungsart 2

? Tatsächliche Strukturen mit geringer Ws
32
Übersicht

• RNA falten
• Sekundärstrukturen und Funktion
• Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence
• Grundidee
• Vorgehen Schritt 1
• Vorgehen Schritt 2
• Beispiele
• Leptomonas collosoma
• Bakteriophage ?
• Auswertung
• Probability Profiling
• Accessibility Plots
• Samplegröße
• Sfold
• RNA finden

33
Beispiele Bakteriophage ?

• Zwischen-Ergebnis aus Tests mit L.
  collosomaAlgo erzeugt viele alternative
  Strukturen
• Weitere Untersuchung mit Vorhersage von
  mRNA-Strukturen
• Charakteristische Bereiche der cIII-mRNA des
  Bakteriophagen ?
• das Startcodon (AUG) (0 bis 3)
• die Shine-Dalgarno-Sequenz (-13 bis -7) nötig
  zur Translationsinitiierung
• Kommt in 2 Konformationen vor
• Vorgehen
• Sampling-Schritt 100 mal wiederholt
• Die 100 erzeugten Strukturen von Hand betrachtet
  und charakterisiert

34
Beispiele Bakteriophage ?

• Struktur A Shine-Dalgarno-Sequenz und Startcodon
  in Sekundärstrukturen keine Translation
• Struktur B Shine-Dalgarno-Sequenz und Startcodon
  zugänglich Translation möglich

rightmost stem
leftmost stem
middle stem
35
Beispiele Bakteriophage ?

• Ergebnis des Samplings
• 89/100 Strukturen leichte Variationen von
  Struktur A
• leftmost-Stem in 67/89 exakt vorhergesagt
• rightmost-Stem in 72/89 nahezu exakt vorhergesagt
  (gelegentlich 2 zusätzliche Paare)
• 3/100 Strukturen Variationen von Struktur B
• zusätzliche Helix in SD-Sequenz enthalten
• 8 Strukturen, die weder an A noch an B erinnern

rightmost stem
leftmost stem
middle stem
36
Übersicht

• RNA falten
• Sekundärstrukturen und Funktion
• Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence
• Grundidee
• Vorgehen Schritt 1
• Vorgehen Schritt 2
• Beispiele
• Leptomonas collosoma
• Bakteriophage ?
• Auswertung
• Probability Profiling
• Accessibility Plots
• Samplegröße
• Sfold
• RNA finden

37
Beispiele - Auswertung

• Algorithmus erzeugt leicht suboptimale Faltungen,
  die nahe der MFE liegen
• ABER suboptimale Faltung ist nicht gleich
  tatsächlicher (suboptimaler) Faltung
• Erklärung der Autoren unbekannte Einflüsse der
  Tertiärstruktur für verantwortlich für Stabilität
• Besser geeignet zur Faltung von mRNA als für
  funktionelle RNA (z.B. spliced leader)

38
Übersicht

• RNA falten
• Sekundärstrukturen und Funktion
• Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence
• Grundidee
• Vorgehen Schritt 1
• Vorgehen Schritt 2
• Beispiele
• Leptomonas collosoma
• Bakteriophage ?
• Auswertung
• Probability Profiling
• Accessibility Plots
• Samplegröße
• Sfold
• RNA finden

39
Probability Profiling

• Einzelsträngige (ungepaarte) RNA-Regionen
  interagieren potentiell mit
• DNA
• RNA
• Proteinen (z.B. in Translation)
• Vorhersage dieser accessible sites mit dem
  Sampling-Teil des Algorithmus
• Erstellen von Probability Profiles (Diagramme)
  der Weite W (in Nukleotiden)
• An Position i wird die Ws aufgetragen, dass die
  Nukleotide i bis i(W-1) ungepaart sind(ergibt
  sich aus Multiplikation der Einzelwahrscheinlichke
  iten (aus Statistik))
• Zum Vergleich ss-count Statistik, in wieviel
  Prozent aller erzeugten Faltungen Base i
  ungepaart war

40
Probability Profiling - Beispiel

• mRNA Homo sapiens ?-Glutamyl-Hydrolase
• Nukleotide 0 60

41
Probability Profiling - Beispiel

• mRNA Homo sapiens ?-Glutamyl-Hydrolase
• Nukleotide 1261 1322

42
Probability Profiling - Ergebnis

• MFE-Struktur gibt für Vorhersage von accessible
  sites keine Hinweise
• Da nur 1 Struktur die MFE-Struktur ist
• Binäre Entscheidung in 1 Struktur ist Base in
  Basenpaar oder nicht
• ss-count betrachtet nur Statistik eines
  Nukleotids, keine Aussage über nachfolgende
• Probability Profile verlässlichste Aussage der 3
  Möglichkeiten
• da Ws der nachfolgenden Paarungen berücksichtigt

43
Probability Profiling für Loops

• Bisher nur berücksichtig ob gepaart oder
  ungepaart
• Sampling-Schritt gibt aber mit zurück, in welchem
  Loop-Typ sie enthalten sind
• ? Probability Profiling für bestimmte Loops
  möglich

44
Probability Profiling für Loops

• Loop-Probability-Profiles für Escherichia coli
  Alanin-tRNA

Hairpin
Bulge
External
Internal
Multi
Multi
dangling-3-Ende aus Nukleotiden
Kleeblattstruktur der tRNA
Enthält keine Bulges oder Internal Loops ? dort
keine Peaks
16 der gesampelten Strukturen haben einen
einzelsträngigen Bereich, der zwei gefaltete
Domänen vebrindet
45
Probability Profiling für Loops

• Weitere Bedeutung des Hairpin-Loop-Profiles
• Höchster Peak ? konserviertester Loop
• HPlot-Ws der Basen des Anticodon-Loops
• G34 0,968
• G35 0,961
• C36 0,962
• ? Selbst wenn sich die restliches Strukturnicht
  zum Kleeblatt faltet, bleibt dieseaccessible
  site erhalten
• Untersuchung weiterer tRNAs interessant, aber
  schwierig, da modifizierte Basen vorhanden

46
Übersicht

• RNA falten
• Sekundärstrukturen und Funktion
• Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence
• Grundidee
• Vorgehen Schritt 1
• Vorgehen Schritt 2
• Beispiele
• Leptomonas collosoma
• Bakteriophage ?
• Auswertung
• Probability Profiling
• Accessibility Plots
• Samplegröße
• Sfold
• RNA finden

47
Probability Profiling für Accessibility Plots

• Probability Profiles geben Differenzierung
  zwischen gebunden / einzelsträngig
• Nucleinsäuren müssen einzelsträngig sein, um zu
  interagieren
• Probability Profiles überlagern, um Interaktion
  vorherzusagen

• Target Homo sapiens ?-Glutamyl-Hydrolase mRNA
• Antisense insgesamt 1233 nt
• Gute Zugänglichkeit zwischen 730 und 750 (target)
• Zugängliche Bereiche müssen nicht an gleichen
  Stellen liegen
• Sollten aber gleich lang sein

48
Übersicht

• RNA falten
• Sekundärstrukturen und Funktion
• Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence
• Grundidee
• Vorgehen Schritt 1
• Vorgehen Schritt 2
• Beispiele
• Leptomonas collosoma
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• Auswertung
• Probability Profiling
• Accessibility Plots
• Samplegröße
• Sfold
• RNA finden

49
Sampelgröße

• Standardgröße 1000 repräsentativ!
• Beispiel Homo sapiens ?-Glutamyl-Hydrolase mRNA
• 1187 nt ? 10303 Sekundärstrukturen (Vergleich
  1080 Atome im Universum)
• 2 Sammlungen von 1000 Samples erstellt
• Für jede Sammlung ein Histogramm
  erstelltHistogramme sind identisch
• Probability Profiles erstelltnahezu
  deckungsgleich
• Aber keine einzige Struktur kommt doppelt vor

50
Samplegröße - Histogramme
51
Samplegröße - Probability Profiles
52
Übersicht

• RNA falten
• Sekundärstrukturen und Funktion
• Algorithmus zur RNA-Faltung von Ding und Lawrence
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• Beispiele
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• Bakteriophage ?
• Auswertung
• Probability Profiling
• Accessibility Plots
• Samplegröße
• Sfold
• RNA finden

53
Sfold

• Algorithmus integriert in Paket Sfold
• Erhältlich z.B. über sfold.wadsworth.org
• Laufzeit des Algo O(n³)
• Vergleich Eddy/Rivas O(n6)
• Reeder/Giegerich O(n4)
• Aber dafür mit Pseudoknoten

Sequenz Länge (nt) Zeit (sek) Speicher (MB)
E. coli tRNAAla 76 1,48 14,6
H. sapiens BCRP mRNA 2418 3.505,86 149,2
H. sapiens ESR mRNA 6450 92.995,25 969,1
Vergleich von Rechenzeit und Speicherverbrauch
beim Berechnen der Zustandssummen und
anschließendem Sampeln von 1000 Strukturen
54
Übersicht

• RNA falten
• RNA finden
• Motivation und Ansätze
• Modelle
• Prinzip
• Parameterschätzung
• Piktogramme
• Algorithmus
• Tests und Ergebnisse
• Verbesserungen

55
Übersicht

• RNA falten
• RNA finden
• Motivation und Ansätze
• Modelle
• Prinzip
• Parameterschätzung
• Piktogramme
• Algorithmus
• Tests und Ergebnisse
• Verbesserungen

56
Motivation Ansätze

• Gefaltete RNA funktionell bedeutsam
• Steuerung der eigenen Translation
• Funktion als tRNA
• Ribozyme
• Nicht alle RNA wird wie mRNA translatiert
• Nicht alle Gene auf DNA codieren für Proteine
• Einige kodieren auch für funktionelle nicht
  kodierende RNA (ncRNA)
• Ziel Gene auf DNA erkennen, die für ncRNA
  kodieren
• Problem entsprechende Gene bisher nicht
  einheitlich charakterisierbar

57
Motivation Ansätze

• Maizel 1988
• Sekundärstruktur bestimmt Funktion
• Funktionelle RNA muss also stabile
  Sekundärstruktur haben
• Stabil Minimum der freien Energie
• Ergebnis Faltungsvorhersage weniger divers
• Ergebnisse enttäuschend
• Badger Olsen 1999
• Anderes Gebiet Identifizierung von codierenden
  Regionen in Bakterien
• Arbeitet mit Alignments von Sequenzen
• Nutzen BLASTN um Sequenzidentität zwischen 2
  Species zu bestimmen
• Programm CRITICA untersucht Mutationsmuster der
  gaplosen Bereiche
• Mutationen, die AS nicht verändern (synonym)
  Score
• Mutationen, die AS verändern - Score

58
Motivation Ansätze

• Rivas Eddy 2001
• Aufbauend auf Idee von Badger Olsen
• Erweiterungen Probabilistisches Modell (Aussage
  mit Ws)
• dritter zusätzlicher Zustand (funktionelle
  RNA)
• Alignments mit Gaps zugelassen
• Alignment nur teilweise relevant (irrelevante
  Flanken möglich)
• Ziel gegebene Sequenz klassifizieren in
• Kodierend für Proteine
• kodierend für ncRNA
• Andere Bereiche
• Ansatz findet ncRNA mit konservierter Struktur
  Probleme
• Manche bekannte ncRNA-Gene nicht konserviert
• Manche konservierte Bereiche nicht ncRNA-Gene
• ncRNA-Gen beschreibt Bereich mit konservierter
  Struktur, Funktionalität muss untersucht werden

59
Motivation Ansätze

• Eingabe eines Alignments zweier verwandter Genome
  (DNA-Sequenzen)
• Analyse der beobachteten Mutationen
• Kodierend Synonyme Mutationen (gleiche AS
  kodiert)
• Funktionell kompensierend, Struktur erhalten
• Keins zufällige Mutation
• Analyse
• Jeder Fall 1 Modell, das entsprechende Sequenzen
  baut
• Nachbau des Alignments mit den 3 Modellen
• Ausgabe der Ws, dass Alignment einem Modell
  enstpringt
• Modell mit höchster Ws gewinnt

AGTGCTAGCT
GATGCTAGCT
ncRNA?
60
Übersicht

• RNA falten
• RNA finden
• Motivation und Ansätze
• Modelle
• Prinzip
• Parameterschätzung
• Piktogramme
• Algorithmus
• Tests und Ergebnisse
• Verbesserungen

61
Modelle - Prinzip

• OTH (weder kodierend noch funktionell)
• pair-HMM
• 16 verschiedene Parameter pOTH(a,b) Ws(a in
  Seq X, b in Seq Y)
• Wahrscheinlichkeit des Alignments Produkt der Ws
  der alignierten Positionen

HMM
pair-HMM
GTTAACTGAGTAACG
x x x x
GTTAACTGAGTAACG
GCAAGCTGAGTTACG
62
Modelle - Prinzip

• COD (Gen kodierend für Proteine)
• pair-HMM
• Alignierte Sequenzen sollten für gleiches Protein
  kodieren
• Synonyme Mutationen, AS-Sequenz unverändert
• 64 64 Parameter pCOD(a1a2a3, b1b2b3)
• Emission erfolgt Codon für Codon
• Gleichzeitig a1a2a3 in Sequenz X
• b1b2b3 in Sequenz Y
• Ws des Alignments für einen Reading-Frame
  Produkt der Doppel-Codon-Ws
• Richtiger Reading-Frame nicht bekannt
• Ws des Alignments

1 Ereignis
Sequenz X
GGT
GGA
Sequenz Y
G
f Frame P(fCOD) 1/6
63
Modelle - Prinzip

• RNA (Gen kodierend für ncRNA)
• pair Stochastic Context Free Grammar (pSCFG)
• Mutation ändert Sekundärstruktur nicht
• Von gleichen Positionen zu gleichen Positionen
  Watson-Crick-Paarung möglich
• Abschnitte in Sek-Struktur 16 16
  Parameter pRNA(aLaR, bLbR)
• Ws (Emission eines Basenpaars in X, homologes
  Basenpaar in Y)
• Ungepaarte Abschnitte 4 4 Parameter pRNA(a,
  b)
• Analog zu OTH-Modell
• Ws für ein Alignment mit Struktur s Produkt aus
• pRNA(xixj, yiyj) für gepaarten Positionen i,j
• pRNA(xk, yk) für einzelsträngige Positionen k
• Richtige Struktur nicht bekannt
• Ws des Alignments

p
u
v
TTGTTCGAAAGAACG
TTGACCGAAAGGTCG
s Sekundärstruktur
64
Modelle - Prinzip

• Problem bei RNA-Modell
• In COD-Modell alle Frames gleich wahrscheinlich
• Gilt nicht für Sek-Strukturen in RNA-Modell
• P(sRNA) muss für jedes s berechnet werden
• Gelöst durch früheren Algorithmus von Rivas und
  Eddy
• Viertes Modell (IID)
• Erzeugt unabhängige Sequenzen
• 8 Parameter pX(a) pY(b)
• Klassifikation durch Likelihoods
• Wahrscheinlichkeit des Modells gegeben die Daten
• Bayessche-Posteriori-Ws berechnet a priori alle
  3 Modelle gleich wahrscheinlich
• Hohe RNA-posteriori-Ws Alignment Kandidat für
  ncRNA-Gene
• Beurteilung der Güte der Aussage durch
  log-odds-Score

65
Übersicht

• RNA falten
• RNA finden
• Motivation und Ansätze
• Modelle
• Prinzip
• Parameterschätzung
• Piktogramme
• Algorithmus
• Tests und Ergebnisse
• Verbesserungen

66
Modelle - Parameterschätzung

• 4392 Emission-Ws zu bestimmen
• Ideal Trainings-Sets aus Alignments von
• Real existierenden RNAs
• Kodierende Genomregionen
• Konservierte nicht kodierende Regionen
• Keine genügend großen Trainings-Sets verfügbar
• Mit zufällig erzeugten Sequenzen
• Sequenzen erzeugen
• Mit Werten aus AS-Substitutionsmatrizen
  (BLOSUM62) Codon-Ws errechnen (pCOD)
• Daraus Nucleotid-Substitutions-Ws des OTH-Modells
  errechnen
• OTH-Ws mit Basenpaarhäufigkeiten kombinieren ?
  RNA-Ws
• 48 Transitions-Ws
• von Hand erzeugt Modelle generieren Sequenzen,
  mit realen verglichen
• Suboptimale Methode, bisher aber keine Alternative

67
Übersicht

• RNA falten
• RNA finden
• Motivation und Ansätze
• Modelle
• Prinzip
• Parameterschätzung
• Piktogramme
• Algorithmus
• Tests und Ergebnisse
• Verbesserungen

68
Modelle - Piktogramme

• IID-Modell erzeugt 2 unabhängige Sequenzen

X
Emittiert in Seq. X
F
S
K
T
Y
Emittiert in Seq. Y
69
Modelle - Piktogramme

• OTH-Modell erlaubt lokale Alignments zwischen 2
  Sequenzen

X
X emittiert in X, Gap in Y XY emittiert in X
und Y Y emittiert in Y, Gap in X
FL
FR
B
XY
E
Y
F Flanking States
FJ
O
70
Modelle - Piktogramme

• COD-Modell Alignment kodierender Bereiche
  eingebettet in unabhängige Bereiche
• Neuer Typ von Zuständen COD
• Ermöglichen indels (Insertionen oder
  Deletionen)
• Kompensieren Verlust durch Shotgun-Sequenzierung
  BLASTN (positions-unabhängig)
• Emission von ungleichen (und überzähligen)
  AS-Anzahlen
• Exemplarische Angabe der entsprechenden Ws

C(3,3)
C(3,2) 3 verschiedene Zustände
C(3,4) 4 verschiedene Zustände
C(3,0)
Alle Möglichkeiten p?,?(a1a?,b1b?) ?,? ?
0,2,3,4 a,b ?A,C,G,U
71
Modelle - Piktogramme

• COD-Modell Alignment kodierender Bereiche
  eingebettet in unabhängige Bereiche

C(3,0)
OB
B
E
OE
C(0,3)
OJ
72
Modelle - Piktogramme

• RNA-Modell erzeugt ncRNA-Gene eingebettet in
  unabhängige Bereiche
• Grammatik hat 3 verschiedene Zustände
  (nicht-Terminale)
• V Sequenzfragment, dessen Enden sicher gepaart
  sind
• W Sequenzfragment, dessen Enden eventuell
  gepaart sind
• WB wie W, wird nur benutzt, um Multi-Loops zu
  starten

• 2 Arten von Emissionswahrscheinlichkeiten

aL.aR
bL.bR
WB identisch
Emission ja/nein
Emission von gepaarten Nukleotiden in beide
Sequenzen
Nukleotid-Vektor
Emission von ungepaarten Nukleotiden
Erzeugen Gaps im Alignment
73
Modelle - Piktogramme

• RNA-Modell erzeugt ncRNA-Gene eingebettet in
  unabhängige Bereiche

RNA
OB
OE
OJ
74
Übersicht

• RNA falten
• RNA finden
• Motivation und Ansätze
• Modelle
• Prinzip
• Parameterschätzung
• Piktogramme
• Algorithmus
• Tests und Ergebnisse
• Verbesserungen

75
Algorithmus - Vorgehen

• Eingabe paarweises Sequenz-Alignment von L
  alignierten Paaren
• Scoring des Alignments
• OTH, COD (HMM) Viterbi/Forward Speicher
  O(L) Zeit O(L)
• RNA (SCFG) CYK/Inside Speicher O(L²) Zeit
  O(L³)
• Für jedes Modell Ws, dass Alignment von Modell
  generiert wurde
• Alignment Klassifizieren (Bayessche-Posteriori-Ws
  )
• Annahme P(Modeli) sind gleich

Ws der Klasse bei gegebenem Alignment
Ws des Alignments bei verwendetem Modell
Ws des Modells
Ws des Alignments
76
Algorithmus - Ergebnis

• Bilden von log-odds-Score zur Gütebeurteilung
• ld ( beobachtet / erwartet )
• Aussage darüber, wie nahe Erwartung an
  beobachtetem Ereignis ist
• Annahme weder für Proteine noch ncRNA kodierend
• Log-odds-Score von COD und RNA zu OTH bilden
• 2 Werte, als Koordinaten in Diagramm
• Diagramm-Repräsentation der Information(Phase
  Diagram)
• 3 verschiedene Fälle
• y gt x y gt 0 ? RNA
• x gt y x gt 0 ? COD
• x lt 0 y lt 0 ? OTH

77
Übersicht

• RNA falten
• RNA finden
• Motivation und Ansätze
• Modelle
• Prinzip
• Parameterschätzung
• Piktogramme
• Algorithmus
• Tests und Ergebnisse
• Verbesserungen

78
Tests und Ergebnisse

• Tests mit simulierten Daten
• Sinn Daten im Voraus eindeutig klassifiziert,
  Leistungsfähigkeit beurteilbar
• Jedes der 3 Modelle (OTH, RNA, COD) generiert
  1000 200nt lange Alignments
• Alle 300 Alignments durch Algorithmus bewertet
  und klassifiziert
• Klassifizierung soll auf Mutationsmuster beruhen,
  nicht auf Sequenzidentität oder Gap-Häufigkeit
• Spalten der Alignments zufällig neu
  zusammengesetzt
• Sequenzidentität und Anzahl der Gaps
  beibehaltenMutationsmuster, das Veränderung
  erklärt hat, zerstört
• Darstellung in Phase-Diagrams

79
Tests und Ergebnisse

• Phase-Diagram der durch COD-erzeugten Alignments

RNA
OTH
COD
blau Klassifizierung der original
Alignments rot Klassifizierung nach Shuffling
80
Tests und Ergebnisse

• Phase-Diagramm der durch RNA erzeugten Alignments

RNA
OTH
COD
blau Klassifizierung der original
Alignments rot Klassifizierung nach Shuffling
81
Tests und Ergebnisse

• Phase-Diagramm der durch OTH erzeugten Alignments

RNA
OTH
COD
blau Klassifizierung der original
Alignments rot Klassifizierung nach Shuffling
82
Tests und Ergebnisse

• Tests an simulierten Genomen
• Sinn Untersuchen der Tendenz zu false
  Positives, wenn COD und OTH dominieren
• Erzeugen von 2 Pseudobakteriengenomen ohne
  funktionelle RNA
• Länge 2 Megabasen
• Länge kodierender Regionen normalverteilt um
  900nt
• Länge nichtkodierender Regionen normalverteilt
  um 100nt
• 90 kodierend
• GC-Gehalt 1) 38,90
• 2) 47,25
• 3) 57,70
• Anzahl der false Positives
• 1) 8
• 2) 14
• 3) 21
• Erneute Analyse von Genomsatz 3 mit neuem
  Parametersatz 1 false Positive
• Sensitivität sinkt mit steigendem GC-Gehalt, kann
  angepasst werden

83
Tests und Ergebnisse

• Tests an realen Genomen
• Sinn Test unter realistischen Bedingungen
• Analyse der Genome von Escherichia coli und
  Salmonella typhi (eng verwandt)
• Bekannt 115 RNA-Gene (22 rRNAs, 86 tRNAs, 7
  andere) 4290 kodierende Gene
• Genom aufgeteilt in 3 Bereiche 115 RNA-Features
  (1 des Genoms) 4290 ORF-Features (88 des
  Genoms) 2367 intergene Sequenzen (11 des
  Genoms)
• Jede der 3 Sammlungen gegen Salmonella typhi
  aligniert, bewertet

84
Tests und Ergebnisse
ncRNAs ORFs
vorhanden 115 4290
In Alignments (gt50nt, E lt 0,01) 33 3181
erkannt als RNA 33 20
erkannt als COD - 2876
erkannt von alignierten 100 90,4
erkannt von gesamt 28,6 67

• Problem Blast lieferte nicht ausreichend viele
  signifikante Alignments
• Von alignierten Sequenzen Großteil erkannt

85
Übersicht

• RNA falten
• RNA finden
• Motivation und Ansätze
• Modelle
• Prinzip
• Parameterschätzung
• Piktogramme
• Algorithmus
• Tests und Ergebnisse
• Einsatz und Verbesserung

86
Einsatz Verbesserung

• Anwendungsgebiete
• Erkennen von Kandidaten für ncRNA positiv
  identifizierte Regionen weiter untersuchen
• Erkennen von für Proteine kodierende Regionen
• Fehlerquellen und Verbesserungen
• Modelle für fixe evolutionäre Distanz (BLOSUM 62)
  passt nicht auf alle eingegebenen Daten
• BLASTN zum Alignieren von positionsunabhängig
  evolvierten SequenzenAlignment mit
  Sankoff-Algorithmus sehr teuer Zeit O(L6),
  Speicher O(L4)
• Training mit zufällig erzeugten Daten nicht
  optimaltrainiertes System scheint RNA-Modell zu
  favorisieren
• Verfahren sucht nach konservierter
  Sekundärstrukturkann keine ncRNA erkennen, die
  nur sehr wenige Sekundärstrukturen ausbildet
• Fehlklassifizierung von mRNA mit stark
  ausgebildeter Sekundärstrukturz.B. zur
  Translationskontrolle

87
Übersicht

• RNA falten
• RNA finden
• Quellen

88
Quellen

• A statistical sampling algorithm for RNA
  secondary structure prediction Nucleic Acids
  Research 31(24) S.7280-7301 Ding, Ye,Lawrence,
  Charles E. 2003
• Noncoding RNA gene detection using comparative
  sequence analysis BMC Bioinformatics 2(8) Eddy,
  Sean R.,Rivas, Elena 2001

89
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