Diapositive 1

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La protéomique dexpression différentielle
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Lanalyse différentielle consiste à comparer au
travers de la présence des molécules biologiques,
deux situations.
Ceci est réalisé quotidiennement dans les LAM
détection dun syndrome dinflammation révélé par
la présence de la protéine CRP. Si on cherche à
comprendre lamplitude et lévolution du
syndrome, il est nécessaire de corréler la
concentration sérique de la CRP avec celles de
lorosomucoïde et de lhaptoglobine.
Pour découvrir sans a priori de nouvelles
molécules dintérêt
Transcriptome évènements post-traductionnels
pas vus et les aspects cinétiques au niveau des
protéines pas considérés
Protéome la méthode la plus utilisée
actuellement la 2D-PAGE Une nouvelle méthode
lICAT (Isotope Coded Affinity Tag)
John YATES Actuellement responsable dun
laboratoire au Scripps Research Institute La
Jolla en californie
Patrick OFARRELL 1970 Actuellement responsable
dun laboratoire à lUniversité de Californie
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La protéomique dexpression différentielle par
gel 2D
Deux conditions (ex cancer pas cancer,
traitée-non traitée)
Les protéines modifiées entre deux situations
cellulaires distinctes doivent être effectivement
détectables sur gels 2D et à un taux permettant
leur identification
Les variations détectées devront être répétitives
et statistiquement validées
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Enrichissement en protéines dintérêt avant la 2D
Sur un gel le rapport dintensité entre le plus
petit et le plus gros spot est de 104
Dans une cellule la dynamique dexpression est au
moins de 105 voire de 106
Les protéines impliquées dans la transduction de
signaux sont rarement mises en évidence sur les
gels 2D (100 à 1000 protéines par cellule). Or
ces protéines assurent des fonctions très
importantes en terme de régulation. Il faut donc
utiliser des moyens qui permettent de faire des
tris sélectifs de molécule.
Tri par différences de solubilité
Pas la cellule entière mais seulement un des
compartiments ou organites noyau, cytoplasme,
mitochondrie
Extraction sans détergent va favoriser
lextraction des protéines cytoplasmiques
Lutilisation de solutions ayant un pouvoir
dextraction croissant va favoriser la
solubilisation des protéines hydrophobes
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Enrichissement en protéines dintérêt avant la 2D
Pré-fractionnement des extraits par
chromatographie et méthodes dérivées
Sans a priori
Fractionnement de lextrait protéique selon un
critère physico-chimique (charge,
hydrophophilie,). Toutes les fractions sont
ensuite analysées par 2D.
Avec a priori
Sélection dune famille de protéines
phosphoprotéome, glycoprotéome
Anti-phosphotyrosine
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Enrichissement en protéines dintérêt avant la 2D
Pré-fractionnement des extraits par
isoélectrofocalisation
Rotofor
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Deux approches danalyse différentielle des gels
2D
Comparaison statistique entre plusieurs gels
DIGE DIfferential Gel Electrophoresis
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Acquisition des images
x
y

• Méthode de détection
• Sensible
• Linéaire

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Méthode de détection
µg
Bleu de coomassie alcoolique ou colloïdal Métaux
lourd Sonde fluorescente
0,2 ng
Gamme étroite
2 ng
Instrumentation de digitalisation
Tube photosensible scanner (lampe fluorescente
ou faisceau laser)
Trans-illuminateur à décharge gazeuse caméra
CCD refroidie
Écran phosphorescent
Typhoon
PhosphorImager
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Les logiciels danalyse dimage
Système dexploitation non programmable
Année 70 Gellab, Tycho, Lips ou Elsie
Année 80 Quest, Mélanie et Kepler
Unix
Année 90 Mélanie II, PDQuest, Phoretix 2D
Windows 95 ou NT
Aujourdhui Progenesis développé par NonLinear
Dynamics Newcastle Mélanie 4 developpé par SIB à
Genève
Windows XP
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Progenesis
80 000
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Mélanie
Version gratuite sans la 3D
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Analyse statistique
Une analyse différentielle fiable nécessite une
comparaison entre des séries dau moins trois à
quatre gels

• Outils statistiques
• Analyse heuristique
• Analyse par correspondance

Détermination de la dispersion entre les gels des
différentes séries
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Les protéines cytoplasmique des cellules humaines
du lymphome de Burkitt
antiIgM
951 spots
Lymphome malin non différencié, retrouvé en
Afrique centrale mais également dans d'autres
régions du monde. La principale manisfestation
est une grande lésion ostéolytique de la mâchoire
inférieure ou une masse abdominale.
Michel CARON Paris 2002
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Analyse protéomique du carcinome hépatocellulaire
Jean Rosenbaum Bordeaux 2002
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Nicotinamide N-methyltransferase
Ig Kappa Chain V
Tissu non tumoral
Nicotinamide N-methyltransferase
Ig Kappa Chain V
CHC
Reproductibilité des gels delectrophorèse 2D
gels résultant de 4 expériences indépendantes
réalisées sur le même échantillon
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Cas 1 Cas 2 Cas 3 Cas 4
Tissu non tumoral
CHC
Diminution de la formininotransferase
cyclodesaminase dans les CHC
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Clusterisation hiérarchique
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Protéines sur-exprimées dans le foie tumoral
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Protéines sous-exprimées dans le foie tumoral
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DIGE DIfferential Gel Electrophoresis
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N-hydroxy-succinimidyl ester réaction de
substitution nucléophile avec le groupe amine en
e des lysines pour former une amide
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Differential 2D-Gel Electrophoresis (DIGE)
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Esophageal Scans Cell Cancer-specific Protein
Markers
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Esophageal Scans Cell Cancer-specific Protein
Markers
DIGE gel images of normal and cancer cells
Cy3 image of proteins from normal cells
Cy5 image of proteins from tumor cells
SYPRO Ruby-stained gel image
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Effects of Culture on Abundance of Myocyte
Proteins
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iTRAQ développé par Applied Biosystem
The iTRAQ reagents consist of a charged reporter
group, a peptide reactive group and a neutral
balance group. The peptide reactive group reacts
with primary amines and labels all peptides. An
increase in the overall protein coverage results
from all peptides being labeled.
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As these tags are isobaric in MS, quantitation
occurs in MS/MS using reporter ions.
Investigation of 75,000 accumulated MS/MS spectra
identified a quiet region between m/z of 113-119.
Reporter ions reside in this quiet region.
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Depiction of a multiplexed reaction of 4
different samples. MS/MS spectra of iTRAQ
reagent labeled peptide shows good y- and b- ions
for peptide sequencing. Zoomed section shows the
reporter ions used for quantitation. Efficient
multiplexing (n4) allows multiple comparisons
across samples that enable the inclusion of
duplicates and triplicates into experimental
design.
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MS/MS spectra of BSA peptide AEFVEVTK labeled
with iTRAQ reagents shows a significant
enrichment of both the y- and b- ions (without
peak splitting), providing higher confidence in
peptide identifications. Data collected on Q
TRAP System.
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