Muta

1
Mutações
MECANISMOS DE REPARO DO DNA SÍNDROMES DE
INSTABILIDADE CROMOSSÔMICA
Profa.
Dra. Ana Elizabete Silva Departamento
de Biologia
2
ESTABILIDADE GENÉTICA
SOBREVIVÊNCIA E REPRODUÇÃO
REPLICAÇÃO PRECISA DO DNA REPARO DO DNA
Falhas
Aberrações cromossômicas mudança no genoma
Mutações no DNA doenças genéticas (câncer)
3
TIPOS DE LESÕES NO DNA
Estimativa 100.000 lesões célula/dia (quebras
SSB, perdas de bases espontâneas, outras lesões)
Exposição ao sol (UV) induz 100.000
fotoprodutos/queratinócito
4
Preservação da Integridade do Genoma
Mecanismos para manutenção do genoma
Sistemas de checkpoint e tolerância
Diversos mecanismos de reparo do DNA
Ativação do câncer e senescência, ou morte celular
5
LESÕES RETARDAM PROGRESSÃO DO CICLO CELULAR
ATM P53
Reparo do DNA
Bloqueio do ciclo celular (Checkpoint)
Danos DNA
Apoptose
Câncer
Doenças genéticas
Síndromes de instabilidade cromossômica
Envelhecimento
6
MECANISMOS DE REPARO DO DNA
Reparar danos no DNA surgidos espontaneamente ou
induzidos por mutágenos

• Reparo direto
• Reparo de pareamento errôneo (mismatch repair)
• Reparo de excisão de bases
• Reparo de excisão de nucleotídeos
• Reparo de quebras de fita dupla no DNA
• - Reparo Homólogo ou Recombinação
• - Reparo da junção das extremidades

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REPARO DIRETO

• reversão ativa da lesão ? sem retirar a base
  danificada ? muito eficiente
• O6-metilguanina ? transição GC para AT
  (produzida endogenamente ou mutagênicos químicos?
  alquilantes)
• Enzima MGMT (metil guanina metiltransferase) ?
  remove o grupo metil
• alto custo energético ? uma molécula da enzima é
  inativada para cada lesão corrigida

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O6-metil guanina O6-etil guanina E.coli e
mamíferos
Reparadas pela O6-metilguanina DNA
metiltransferases (MGMT)  
Transfere grupo alquil (metila) para uma cisteína
da DNA metiltransferase
A proteína é inativada
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REPARO DIRETO
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REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO MISMATCH REPAIR -
MMR

• reparo pós-replicação bases incorporadas
  erroneamente no DNA durante a replicação (DNA
  pol 1 base errada na cadeia filha/10 milhões pb)
• REVISÃO DE PROVA PROOFREADING DNA pol com
  atividade exonuclease 3 ? 5 corrige 99,9 dos
  erros de replicação
• eliminação de bases mal pareadas e alças de
  deleção/inserção (INDEL)

• atua na cadeia recém-sintetizada (não metilada)
  ? logo após a replicação do DNA
• Genes em humanos MSH, MLH e PMS ? as proteínas
  formam complexos (heterodímeros)
• Genes em procariotos MutS, MutL e MutH

11
Reparo Mismatch em E. coli. Detecta e remove
bases mal pareadas na cadeia de DNA recém
replicada ainda não metilada. MutS reconhece e
liga-se ao par mal pareado MutH reconhece a
cadeia metilada e corta a cadeia não metilada
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REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO MISMATCH REPAIR -
MMR
13

• Mutações em genes MMR segregam com a síndrome de
  predisposição ao câncer colorretal não polipose
  (HNPCC) ? maioria dos pacientes são heterozigotos
  para mutações recessivas na linhagem germinativa
  em genes MMR (MLH, MSH, PMS)
• células tumorais sofrem perda do alelo normal e
  exibem instabilidade de microssatélites? números
  variáveis de repetições de microssatélites nas
  células tumorais

• Câncer de cólon não-poliposo familial
  instabilidade de microssatélites
• 70 a 85 de risco
• mutações em MLH1 e MLH2 são mais comuns
  (diagnóstico precoce)

14
REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO
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REPAROS DE EXCISÃO Reparo de excisão de
bases Reparo de excisão de nucleotídeos
ETAPAS COMUNS etapa 1 incisão (endonuclease)
e excisão (exonuclease) etapa 2 ressíntese do
DNA (DNA polimerases ß, d, e) etapa 3 ligação
das extremidades (DNA ligases)
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REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BER

• reparo de danos causados por agentes endógenos
  danos oxidativos (ROS) ? oxigênio
  reativo,radicais livres H2O2, hidrólises ? que
  modificam a estrutura das bases ou geram sitios
  abásicos (AP)
• reparo de danos induzidos por radiação ionizante
  e agentes alquilantes
• realizado pelas DNA glicosilases cada DNA
  glicosilase ( 8 genes diferentes) reconhece uma
  base alterada no DNA e catalisa sua remoção por
  hidrólise
• Ex. uracila-DNA-glicosilase ? remove a uracila
  do DNA (desaminação da C ? U) ? transição GC ?
  AT
• - quebram ligações base-açúcar
• liberam as bases gerando sítios apurínicos ou
  apirimidínicos (sítios AP)
• sítio reparado por endonucleases específicas

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REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BER

• Etapas
• remoção da base danificada (DNA glicosilase) ?
  sítio AP
• incisão do sítio AP na porção 5 (endonuclease)
• excisão do terminal 5 e remoção (exonuclease) ?
  gerando lacuna de 1 nucleotídeo (via curta) ou
  2-12 nucleotídeos (via longa)
• síntese DNA (DNA polimerase)
• ligação da cadeia (DNA ligase)

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REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BER
Reconhecimento base danificada e remoção DNA
glicosilase Sítio AP
Endonuclease incisão 5 Exonuclease excisão
Síntese DNA polimerase Ligação DNA ligase
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REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BER
2-13 nucleotídeos
1 nucleotídeo
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REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS - NER

• remoção de adutos no DNA ? distorção da dupla
  hélice
• dímeros de pirimidina (radiação UV) , HAP,
  cisplatina
• fatores ambientais
• principal mecanismo de reparo
• deficiência doenças genéticas
• realizado pelo complexo multienzimático XPA-XPG
  (humanos)
• Bactérias complexo UVrA, UVrB, UVrC e UVrD
• remove 22-30 nucleotídeos

21
(No Transcript)
22
REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS - NER

• Etapas
• Reconhecimento da lesão no DNA (complexo XPA-XPC)
  ? ligam-se ao DNA danificado ?
• abertura da dupla hélice ?? atividade de
  helicase ?? XPB e XPD
• Dupla incisão na cadeia danificada 3 (XPG) e 5
  (XPF)
• Excisão ?? remoção do segmento de DNA (30
  nucleotídeos)
• Síntese de DNA ?? DNA polimerase
• Ligação da cadeia ?? DNA ligase

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Reparo por excisão de nucleotídeos (NER)
Reconhecimento dano (XPA-XPC)? interação com
TFIIH ?atividade de helicase
XPG endonuclease que corta a fita em 3
ERCC1-XPF endonuclease que corta a fita em 5
Fragmento 26-27 nucleotídeos
DNA pol, PCNA, RPA e RFC síntese da fita
nova Ligase
http//www.nature.com/nrc/journal/v1/n1/animation/
nrc1001-022a_swf_MEDIA1.html
24
SÍNDROMES ASSOCIADAS A DEFEITOS NO NER
Reconhecimento da lesão
Incisão
Excisão remoção dano
Síntese reparo
25
REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA DUPLA

• DSB (quebra fita dupla)
• lesão espontânea induzida por radicais de O2
  livres e replicação do DNA
• agentes genotóxicos como a radiação ionizante
• causa de aberrações cromossômicas
• Duas vias principais em mamíferos
• Reparo por recombinação homóloga (RH) ?
  pareamento com o cromossomo homólogo intacto
• Reparo de ligação das extremidades não-
  homólogas (NHEJ) ? religação direta das
  extremidades quebradas

26
REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA DUPLA

• Reparo homólogo (RH) ? Etapas
• Reconhecimento da quebra e pareamento do
  cromossomo homólogo intacto com o cromossomo que
  apresenta a quebra dupla
• Degradação das extremidades danificadas
• Deslocamento da cromátide-irmã intacta para o
  sítio a ser reparado
• A cromátide-irmã serve como molde para síntese de
  DNA ?? restaura a sequência original
• Ligação das extremidades

27
REPARO HOMÓLOGO
Cromátides irmãs
28
REPARO HOMÓLOGO
Rad50 Rad52
BRCA1/Rad54 BRCA2/Rad51
Síntese DNA pol
Ligação DNA ligase IV
29
LIGAÇÃO DAS EXTREMIDADES NÃO-HOMÓLOGAS
KU80 e KU70 Processamento das extremidades
XRCC4 /DNA ligase IV ligação das extremidades
DNA reparado com baixa fidelidade
30
Células em proliferação
Células em proliferação ou não
Ligação c/ RPA (proteína de replicação) e RAD51
(recombinase)
Modificação das extremidades KU70 e KU80 recruta
DNA-PK (proteína quinase) ? complexo
Facilita o encontro da cromátide-irmã e invasão
Ligação das extremidades pela LIG4XRCC4
Ligação das extremidades pela LIG1
31
http//www.sbbq.org.br/revista/mtdidaticos/Env.pdf
32
CLASSES DE DISTÚRBIOS AFETANDO A MANUTENÇÃO DO
GENOMA

1. Envelhecimento acelerado síndromes progeróides

2. Tipos de câncer
3. Envelhecimento acelerado e câncer
33
SÍNDROMES COM DEFEITOS NA MANUTENÇÃO DO GENOMA
ENVELHECIMENTO (PROGÉRIA)
Síndrome Genes mutados Processo
Afetado Sintomas Cockayne CSA, CSB, XPB,
NER XPD, XPG Tricotiodistrofia XPB, XPD,
TTDA NER Rothmund-Thomson RECQL4 Deficiência
helicase (reparo de danos
oxidativos) Hutchison-Gilford LMNA função da
lâmina nuclear (Progéria)


34
SÍNDROMES COM DEFEITOS NA MANUTENÇÃO DO GENOMA
CÂNCER
Síndrome Genes mutados Processo
Afetado Câncer mama BRCA1, BRCA2 Reparo
Homólogo familial (quebras duplas) Li-Fraumen
i TP53 Checkpoint G1-S Câncer colorretal
não- MSH2, MLH1 Mismatch repair polipose
hereditário (MMR) (HNPCC)
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SÍNDROMES COM DEFEITOS NA MANUTENÇÃO DO GENOMA
PROGÉRIA CÂNCER
Síndrome Genes mutados Processo
Afetado Xeroderma pigmentoso XPA-XPG NER S.
Bloom BLM Deficiência helicase
(recombinação mitótica) Anemia de
Fanconi FANC Reparo DNA crosslink Ataxia
telangiectasia ATM Reparo DSB S.
Werner WRN Deficiência helicase
(recombinação/reparo DNA manutenção
dos telômeros)
Adolescência - 40 anos
36
Xeroderma Pigmentoso Síndrome de
Cockaine Tricotiodistrofia Anemia de
Fanconi Ataxia telangiectasia Síndrome de Bloom
SÍNDROMES DE INSTABILIDADE CROMOSSÔMICA
?defeitos nos mecanismos de reparo e replicação
do DNA ? freqüência ? aberrações cromossômicas ?
incidência ? câncer
37
XERODERMA PIGMENTOSO (XP)
? AR ? Clínica manifestações cutâneas (1,5
anos) anomalias oculares (4 anos) anomalias
neurológicas progressiva (6 meses) primeiro
câncer de pele (8 anos) ?Xeroderma (pele
seca) ?Incidência 1/250.000 (USA) e 1/40.000
(Japão) ?Células XP sensíveis a radiação UV
indivíduos incapazes
reparar dímeros TT risco ? câncer de pele
(2000x) XP defeito no reparo de excisão de
nucleotídeos (NER)
38

• Grupos de complementação mutações nos genes
  XPA-XPG diferenças clínicas
• defeitos enzimáticos incapacidade de excisar
  danos induzidos pela luz UV e mutagênicos
  químicos
• ? diagnóstico exposição a luz solar

39
TRATAMENTO proteção da pele da luz
solar chapéus óculos que absorvem luz
UV bloqueadores solares roupas
protetoras acompanhamento periódico por
dermatologista
Criança com XP protegida do sol usando máscara e
luvas resistentes a luz UV não apresenta lesões
na pele
40

• Síndrome de Cockayne
• Características
• Anormalidades esqueléticas face parecida com a
  de um passarinho
• - Cáries, cifose e osteoporose em pacientes de
  idade avançada.
• - Degeneração neurológica progressiva início
  precoce, desenvolvimento psicomotor atrasado,
  defeitos no modo de andar e retardo mental.
• Microcefalia
• Perda da audição, retinopatia pigmentar, cabelos
  finos e cataratas

Morte 12,5 anos principais causas pneumonia e
infecções respiratórias
41

• Alterações genéticas
• Dois genes com mutações foram identificados nesta
  síndrome CSA e CSB.
• O gene CSA, responsável pela síndrome de Cockayne
  do tipo 1? cromossomo 5.
• O gene CSB, responsável pela síndrome de Cockayne
  do tipo 2 ? cromossomo 10q11.
• Reparo defeituoso NER

42
TRICOTIODISTROFIA (TTD) ?AR ?Clínica cabelos
quebradiços (deficientes S) iquitiose (escamas
de peixe) retardo mental e físico fácies
distintivas orelhas protuberantes queixo
retraído
43
? descrita 1968
Pollitt e colaboradores
? 50 pacientes fotossensibilidade
NER defeituoso ? TTD não
desenvolvem câncer de pele
TTD
XPB
XPD
Helicases do fator de reparo/transcrição TFIIH
30 grupo de complementação TTD-A (fator de
transcrição basal)
44
ANEMIA DE FANCONI (FA)
?AR ?Clínica anemia aplástica (90
casos) alterações da pigmentação da pele
(64) baixa estatura (62) malformações do
rádio (50) e deformidades do dedo
polegar anomalias oculares (41), renais
(34), microcefalia (37), deficiência mental
(25)
45
?descrita 1927 Guido Fanconi ?
incidência 1/22.000 a 1/476.000 indivíduos ? 8
grupos de complementação FA-A, FA-B, FA-C,
FA-D1, FA-D2, FA-E, FA-F e FA-G
heterogeneidade genética
46

• ? células FA sensíveis à agentes químicos que
  causam ligações cruzadas entre as fitas de DNA
  mitomicina C (MMC), diepoxibutano (DEB), mostarda
  nitrogenada (NM), cisplatina , ...
• freqüência ? de neoplasias leucemias e tumores
  hepáticos
• quebras cromossômicas espontâneas, figuras tri,
  quadri e multirradiais.

47
SÍNDROME DE BLOOM (SB)
?AR ?Clínica ? peso ao nascimento retardo de
crescimento pré e pós-natal (145 cm Homem 130
cm Mulher) telangiectasias e fotossensibilidade
(borboleta) cabeça alongada, microcefalia,
inteligência normal imunodeficiência
infecções (respiratórias e gastrointestinais)
48

• Incidência 1/58.000 judeus
• asquenazim
• Frequencia aumentada de quebras
• cromossômicas figuras quadrirradiais
• mutações no gene BLM
• 15q26.1
• DNA helicase ( RecQ)
• papel na replicação e reparo do DNA
• Risco maior de câncer carcinomas, leucemias e
  linfomas

49
ATAXIA TELANGIECTASIA (AT) SÍNDROME DE LOUIS-BAR
?AR ?Clínica - Degeneração cerebelar progressiva-
Ataxia (12-14 meses) disfunção
neuromotora -telangiectasia dos olhos e pele (3 e
5 anos) - retardo de crescimento (70)
incidência? neoplasias (linfoma e leucemia
linfóide) e imunodeficiências incidência
1/40.000 risco ? câncer de mama
heterozigotos AT
50
?células AT sensíveis a radiação ionizante e
agentes radiomiméticos (N-acetoxi-N-2-acetil-2-ami
nofluoreno - 4-NQO) ? linfócitos AT
rearranjos espontâneos dos cromossomos 7 e 14 ? 4
grupos de complementação A, C, D e E
mutações gene ATM ? gene ATM (11q23)
proteina ATM participa diversas vias controle
transdução de sinal checkpoint ciclo
celular resposta celular ao dano no DNA induzido
por radiação ? gene ATM interage p53 na checagem
G1-S e mutações no gene ATM abolem mecanismo de
reparo pré-síntese de DNA ? defeito
mecanismo de reparo do DNA ou defeito na
replicação DNA
51
(No Transcript)
52
1. Identifique os mecanismos de reparo do DNA
representados nas figuras A, B, C e D. Descreva
as etapas correspondentes de cada mecanismo de
reparo, destacando as principais enzimas (em
humanos) envolvidas em cada etapa. Quais tipos de
lesões podem ser reparadas por cada um desses
mecanismos?
A
53
B
54
C)
55
D
56
2 Identifique as síndromes de instabilidade
cromossômica representadas nas figuras A, B e C.
Pesquise sites sobre as doenças e descreva os
principais sinais clínicos, tipos de câncer
relacionados, mecanismo de reparo defeituoso e
genes envolvidos
A)  
Pacientes apresentam imunodeficiência e
fotossensibilidade na face e as células
apresentam instabilidade cromossômica.
57
B)  Pacientes apresentam telangiectasia
oculocutânea e disfunção neuromotora.
58
C) Pacientes apresentam sensibilidade a luz solar
e risco elevado de câncer de pele desde a
infância.