V12 Bioinformatik-Tools f

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V12 Bioinformatik-Tools für HT Proteinanalyse
traditionelle Ansätze reduktionistisch finde
einzelne Gene und die kodierten Proteinprodukte,
die einen beobachteten Phänotyp definieren. Oft
werden hierdurch komplexe Systeme zu stark
vereinfacht. Hoch-Durchsatzmethoden parallele
Untersuchung vieler gleichzeitiger
Vorgänge omics-Welt Genomics, Proteomics,
Metabolomics, Transcriptomics ...

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Wie soll man das Proteom untersuchen?
Proteomics zerfällt derzeit in 2 Bereiche

• Expression Proteomics
• katalogisiere alle Proteine in
• einer Probe
• differentielle Expression
• Unterschied zwischen mehreren Proben

• Cell-map Proteomics
• Protein-Protein Wechselwirkung
• Protein-Liganden Wechselwirkung
• zelluläre Lokalisation

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Expressions-Proteomik
Das zelluläre Proteom enthält 10.000ende von
Proteinen, deren Konzentrationen mehr als 106
fach verschieden sind.
Prof. Walter (UdS)
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Technologien in Proteomics

• Separation von Proteinen
• 2-D gel Elektrophorese
• Flüssig-Chromatographie
• Affinitäts-Chromatographie

• Annotation einzelner Proteine
• Massenspektroskopie
• kombinierte HPLC und MS
• Protein-Quantifizierung mit MS

Protein-Chips
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Proteinanalyse auf einer proteomischen
SkalaPhizicky et al. Nature 422, 208 (200)
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Analytische versus funktionelle
Protein-Microarrays
(a) analytische Microarrays beobachte
Proteinexpression und klinische Diagnostik.
Vergleiche Proteinproben zweier biologischer
Zustände, wobei die Protein entweder mit einem
grünen oder mit einem roten Farbstoff gelabelt
werden. Wenn eine Farbe überwiegt, liegt das
Protein vornehmlich in dem entsprechenden Zustand
vor.

(b) funktionelle Microarrays visualisieren
Proteinaktivität, -bindung oder
posttranslationelle Modifikationen. Auch geeignet
um Substrat- oder Inhibitor-bindung an Enzyme zu
messen und zur Konstruktion biologischer
Netzwerke.
Phizicky et al. Nature 422, 208 (2003)
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Yeast Two-Hybrid Methoden
(a) die DNA-bindende und die Aktivierungsdomänen
(Kreise) sind an die Protein X und Y fusioniert.
Genexpression des Reporters beginnt. (b)
Standard-2YH-Suche von X gegen eine komplexe
Bibliothek von zufälligen, mit Y fusionierten
Peptid-Schnipseln. (c) 2YH-Array. Screene X
gegen komplette Satz von ORFs.

Phizicky et al. Nature 422, 208 (2003)
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Fluoreszenz entdeckt posttranslationelle
Modifikationen
(c) Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)
zwischen grünem GFP und Farb-stoffmolekül nur
wenn gelbes Protein ein Antikörper gegen
phosphorylierte Tyrosin-reste - an rotes Protein
gebunden ist. FRET ist stark distanzabhängig,
Detektion bis 6 nm Abstand. Bindung (rechts)
führt zu schnellerem Abfall der Fluoreszenz
(unten). (b) In vivo Beispiel. Farbkodierung des
Gewebes gemäss Fluoreszenzdauer des GFP-Signals ?
wieviel phosphoryliertes Tyrosin besitzt rotes
Protein? (a) cDNA-Scan. Jeder Punkt enthält
Zellen, bei denen GFP an unterschiedliche (rote)
Proteine fusioniert ist.

Phizicky et al. Nature 422, 208 (2003)
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Disease ProteomicsHanash, Nature 422, 226
- entdecke veränderte Proteinexpression nicht nur
in Zellen bzw. Geweben, sondern auch in
Subzellulären Strukturen, in Proteinkomplexen und
in biologischen Flüssigkeiten - entwickle neue
Biomarker für Diagnose und Früherkennung von
Krankheiten - identifiziere neue Targets für
Therapieansätze - beschleunige die Entwicklung
von Medikamenten
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Zweidimensionale Gelelektrophorese (2D PAGE)
2D Polyacrylamid-Gel für ein Biopsie-Probe mit
menschlicher Leber. In x-Richtung
nichtlinearer pH-Gradient - geschieht eine
Auftrennung nach dem isoelektrischen Punkt (bei
welchem pH ist die Ladung des Proteins
neutral?). In y-Richtung geschieht durch
Variation des Anteils an Polyacrylamid eine
Trennung nach der molekularen Masse. Problem
man kann nur Proteine visualisieren, die relativ
häufig vorkommen.

Banks et al. Lancet 356, 1749 (2000)
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Annotation von 2D-Gelen mühsam

Banks et al. Lancet 356, 1749 (2000)
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Fallstudie Expressions-Proteomik
Proteine des Rinderherzen welche Proteine sind
im Herzen von Rindern mit einer vererbten
Kardiomyopathie reduziert?

Die Balken 1-6 stammen von Kardiomyopathie-diagnos
tizierten Rindern, 7-12 von gesunden Rindern.
13-16 sind Rinder, die selbst klinisch normal
sind, aber von kranken Rindern abstammen (nur SPP
943 ist deutlich abgesenkt).
Banks et al. Lancet 356, 1749 (2000)
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(Bio)informatische Aufgaben bei Analyse von
2D-Gelen
Zwei Gele stimmen oft in Grösse, Kontrast,
Auftrennung in x- und y-Richtung nicht
überein. Darüberhinaus treten Unterschied als
Folge der experimentellen Bedingungen auf. Der
Vergleich zweier Gele erfordert daher oft
Methoden der Bildbearbeitung, z.B. mit dem
Programm Flicker http//www-lecb.ncifcrf.gov/flic
ker/ Eine Laplace-Transformation verbessert
die Übereinstimmung zwischen dem linken und
rechten Gel erheblich in (b) gegenüber (a).

Lemkin PF, Electrophoresis, 18, 461-470 (1997)
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Fraktionierung der Probe vor 2D PAGE-Analyse
Oft gibt es das Problem, dass die
Proteineigen-schaften über einen sehr grossen
Bereich variieren. Lösung konzentriere auf Teil
der Proteine. z.B. (a) versehe die ansonsten
schwer detek-tierbaren Proteine an der
Membranoberfläche mit einem Biotin Anker
(tag). Auftrennung in 2D-Gel. Erkenne die
markierten Proteine mit Avidin. Identifikation
mit MS. (b) Getrennte Visualisierung der
markierten Proteine (oben) gegenüber der
Darstellung des gesamten Zell-Lysats
(unten). Dies erlaubte die Identifikation neuer
Proteine auf der Oberfläche von Krebszellen.

Hanash, Nature 422, 226 (2003)
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Einsatz von 2D PAGE-Analyse in medizinischer
Diagnose
Die Probleme von 2D Gelen sind, dass die
Methode nicht für grosse Mengen an Proben (HTS)
geeignet ist und relative grosse Probenmengen
benötigt. Die Analyse von klinischen Proben wird
durch die Heterogenität des Gewebes kompliziert.

Hanash, Nature 422, 226 (2003)
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Direkte Visualisierung der Protein-Verteilung mit
MS
Ein gefrorener Schnitt durch ein Rattengehirn
wird mit einem MALDI MS-Gerät abgetastet. Hier
je 15 Spektren für 74 ? 75 Punkte, gleichzeitige
Aufnahme aller Massen. Visualisiere den Schnitt
getrennt für verschiedene Verhältnisse von Masse
und Ladung (jeweils oben rechts gezeigt). z.B.
ist die Proteindichte für m/z6844 recht gering.

Ziel vergleiche gesundes und krankes Gewebe.
Hanash, Nature 422, 226 (2003)
Aufgabe Bildverarbeitung
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Functional Proteomics
Konstruktion eines fluoreszenten Liganden für
Serin-Hydrolasen. (b) Messe die Fluoreszenz in
gesunden und Krebszellen. Identifiziere einen
Cluster von Protease-Lipasen und Esterasen,
deren Anteil in Krebslinien aus verschiedenen
Geweben unterschiedlich ist.

Hanash, Nature 422, 226 (2003)
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Proteomik mit MSAebersold, Mann, Nature 422,
198 (200)
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Proteomics mit Massenspektroskopie (MS)
(1) Aufreinigung (SDS-PAGE). Banden
ausschneiden. (2) Problem Gesamtmasse eines
Proteins ist nicht aussagekräftig. Daher Trypsin
(Protease)-Verdau ? Peptidschnipsel
unterschiedlicher Länge, diese sind
charakteristisch für Protein. (3) MS-Analyse in
Vakuum (4) Detektion der Massenintensität bei
vorgegebenem Verhältnis von Masse m und Ladung
z. (5) Weitere Auftrennung der einzelnen
Peptidschnipsel in zweitem MS-Schritt. Teilweise
Sequenzierung möglich. Aufgabe Annotation des
Proteins aus Sequenz-Datenbank.

Tyers, Mann, Nature 422, 193 (2003)
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Sequenzdiversität in der Zelle Analyse mit MS
Organismus kodiert über das Genom viele
Isoformen. Identifikation der Proteine
durch Datenbanksuche um die Lücken der exp. Daten
zu füllen. Sequenz-Datenbanken enthalten jedoch
keine komplette Information über die natürlich
auftretende Sequenzdiversität.

Rappsilber, Mann, TIBS, 27, 74 (2002)
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Iterativer Zyklus in Systems Biology

Tyers, Mann, Nature 422, 193 (2003)
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Structural ProteomicsSali, Glaeser, Earnest,
Baumeister, Nature 422, 216 (2003)
Ungerichtete Diffusion aller Proteine ist keine
geeignete Organisationsform von biologischen
Zellen. Stattdessen übernehmen stabile oder
transient gebildete Proteinkomplexe viele
wichtige zelluläre Funktionen.
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bekannte Proteinstrukturen

PDZ Domäne CheA Aquaporin Ribosom
Grosse Proteine und Proteinkomplexe sind in der
PDB-Datenbank unterrepräsentiert. Es wird
geschätzt, dass jeder Proteinkomplex für Hefe
ca. 7.5 Proteine enthält.
Sali et al. Nature 422, 216 (2003)
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Struktur grosser Komplexe Kombination von EM
X-ray
Bioinformatik docke atomare X-ray Struktur von
Tubulin (3.5 Å Auflösung) in 8Å-EM-Struktur eines
Microtubulis.

Sali et al. Nature 422, 216 (2003)
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Einzel-Partikel-Analyse mit EM
(a) Komplexe von ca. 44 Tripeptidyl-Peptidase II
Molekülen auf einer Oberfläche. Das Bild zeigt
verschiedene gemittelte Ansichten von Komplexen,
die jeweils die gleiche Orientierung haben (?
Bildverarbeitung). (b) 3D-Rekonstruktion des
TPP II-Komplexes bei 3.3 nm Auflösung. Verschieden
e Blickrichtungen.

Sali et al. Nature 422, 216 (2003)
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Information über Makromolekülkomplexe
Subunit structure atomare Auflösung lt 3
Å Subunit shape mittlere Auflösung gt 3
Å Subunit contact Kenntnis über direkte
Kontakte zwischen Unter-einheiten Subunit
proximity Untereinheiten müssen nicht in
direktem Kontakt stehen. graue Boxen
kennzeichnet grosse experimentelle
Schwierigkeiten.

Sali et al. Nature 422, 216 (2003)
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Hybrid-Methoden für Makromolekulare Komplexe
Structural Bioinformatics (a) Integration
verschiedener Protein- Elemente zu einem
Komplex. (b) Teilweise atomares Modell des
gesamten Hefe-Ribosoms durch Fits von atomaren
Modellen für rRNA und Proteinmodellen in eine
EM-Elektronen-dichte-Mappe des 80S Ribosoms.

Sali et al. Nature 422, 216 (2003)
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Elektronen-Tomographie
(a) Vom Objekt (Mitte) gestreute Elektronen
werden in einem Halbkreis aufgefangen. Ausserdem
wird das Objekt in kleinen Schritten
gedreht. (b) Rekonstruktion (Mathematik) Rück-
Projektion der bei verschiedenen Drehwinkeln
aufgenommenen Streuinfor-mationen. Die
Überlagerung ergibt ein Tomogramm.

Sali et al. Nature 422, 216 (2003)
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Science Fiction Interaktom einer Zelle
links ein Tomogramm einer Zelle stellt im
Prinzip ein räumliches Bild des gesamten Proteoms
einer Zelle dar. Allerdings ist die Auflösung
begrenzt. Versuche dann, die Templates
einzelner Proteine so anzuordnen, dass sich eine
optimale Übereinstimmung mit dem linken Bild
ergibt.

Sali et al. Nature 422, 216 (2003)
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Software-Tools der Systems Biologywerden
natürlich derzeit intensiv entwickelt
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GeneMAPP
Fettsäure-Abbau-Pfad. Jede Box stellt ein Gen
dar. Farbkodierung analog zu Genexpressionsdaten
. Rot bedeutet gt 1.2 fach grössere Expression
in Mäusen mit Kardio-myopathie. Blau bedeutet gt
1.2 fach geringere Expression.
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Visualisierung von Protein-Wechselwirkungen
Darstellung von 14.000 Wechselwirkungen. Stark
vernetzte Komplexe sind am Rand gezeigt.

Tyers, Mann, Nature 422, 193 (2003)
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Fazit Bioinformatik verbindet Genomics und
Proteomics

Bioinformatik bzw. Computational Biology wird
ultimativ ein integriertes Bild des biologischen
Systems erlauben.
Tyers, Mann, Nature 422, 193 (2003)