Analytick

1
Analytické metody

• Vladimíra Kvasnicová

2

1. SPEKTROFOTOMETRIE
2. CHROMATOGRAFIE
3. POTENCIOMETRIE
4. VOLUMETRIE

3
Spektrofotometrie
spektrofotometr
4
Materiál používaný pro analýzu ROZTOK
5

• PRINCIP
• interakce mezi stanovovaným analytem a
  monochromatickým zárením
• cást zárení je absorbovánastanovovanou látkou,
  zbývajícízárení je detekováno detektorem
• množství absorbovaného zárení je prímo úmerné
  množství analyzované látky

6
Spektrofotometrie je kvantitativní metoda
stanovujemeKONCENTRACI
? koncentrace ? tmavší roztok ? ? absorpce
7
Duležité termíny

• vzorek analyzovaný roztok
• neznámý vzorek vzorek o neznámé koncentraci
• standard vzorek o známé koncentraci
• blank roztok neobsahující analyzovanou látku
• chromofor cást struktury chemické látky,
  která je schopna absorbovat
  zárení urcité vlnové délky

8
fialová 380 450 nm modrá 450 495
nm zelená 495 570 nm žlutá 570 590
nm oranžová 590 620 nm cervená 620 750 nm
viz. http//en.wikipedia.org/wiki/Electromagnetic
_spectrum
9
Obrázek prevzat z http//en.wikipedia.org/wiki/Ele
ctromagnetic_spectrum (2006)
10

• Používané elektromagnetické zárení
• barevné vzorky viditelné (VIS)
• bezbarvé vzorky UV zárení

11
A / ? absorpcní spektrum
12
Komplementární barvy
13
SCHÉMA spektrofotometru
14
Které veliciny jsou mereny?

• TRANSMITANCE
• pomer intenzity zárení vystupujícího z kyvety
  (I) k intenzite zárení do kyvety vstupující (Io)
  (tj. zárení dopadající na detektor / puvodní
  zárení)
• T I / Io
• T 0 1 nebo v procentech (0 100 )

15
Jak se vyjadruje množství pohlceného zárení?

• velicina odvozená od transmitance
  ABSORBANCE
• A - log10 T
• - log10 (I/I0) log10 (I0/I) log10 (1/T)
• A 0 1.0 (1.5 nebo více)
• horní limit závisí na citlivosti detektoru

16
T prošlo () pohlceno () A
1 100 0 0
0.99 99 1 0.004
0.90 90 10 0.05
0.50 50 50 0.3
0.10 10 90 1.0
0.01 1 99 2.0
0.001 0.1 99.9 3.0
0.0001 0.01 99.99 4.0
17
T prošlo () pohlceno () A
1 100 0 0
0.99 99 1 0.004
0.90 90 10 0.05
0.50 50 50 0.3
0.10 10 90 1.0
0.01 1 99 2.0
0.001 0.1 99.9 3.0
0.0001 0.01 99.99 4.0
? citlivosti detektoru
18
Zjištení koncentrace

• Lambert-Beeruv zákon
• Kalibracní krivka
• Výpocet pomocí hodnot (A, c) standardních vzorku

19
Zjištení koncentrace

• Lambert-Beeruv zákon
• A ? x l x c
• nebo
• T 10- (? x l x c)
• A absorbance (A -log T)
• T transmitance (T 10-A)
• ? molární absorpcní (extinkcní) koeficient
• l tlouštka kyvety (v cm), c molární
  koncentrace

20
Kalibracní krivka

• 3 a více standardu zpracovaných stejnou metodou
• lineární kalibracní krivka
• A ? x l x c
• y kx q

21
Výpocet pomocí standardu

• Ast cst x l x ?
  Avz cvz x l x ?
• Ast / cst l x ? Avz / cvz l x ?
• l x ? l x ?
• Ast / cst Avz / cvz
• cvz Avz x (cst / Ast)
• cvz Avz x f
• f prumer všech (cst / Ast) použitých pri
  experimentu

22
Cvicení

• 1) Avz 0,25 Cvz ?
• Ast 0,40 Cst 4mg / L
• 2) standard glukózy Cs 1000mg/L, T 0,49.
• neznámý vzorek T 0,55, Cvz ? (v mg/L i
  mmol/L)
• MW 180g
• 3) standard proteinu T 0,33 vzorek pacienta
  T 0,44
• Porovnejte koncentraci proteinu ve vzorku
  pacienta se
• standardem.

23
Presnost stanovení

• absorpce ostatními látkami prítomnýmive vzorku
  musí být eliminována
• BLANK (slepý pokus)
• ? jeho absorbance se odecte od absorbance vzorku
  ? výsledná absorbance odpovídá pouze koncentraci
  analyzované látky

24
Spektrofotometrie v praktickém cvicení

• Stanovení koncentrace kreatininu v moci
• analyzovaný vzorek vlastní moc
• bezbarvý kreatinin je preveden na barevný produkt
  chemickou reakcí
• koncentrace kreatininu ve vzorku se zjištuje z
  namerené absorbance pomocí kalibracní krivky

25
Chromatografie
chromatograf
26
Všechny chromatografické techniky nejsou
instrumentální...
TLC chromatografie úkol v praktiku
27
PRINCIP

• Separace smesi ruzných látek je založena na
  rozdílné distribuci látek mezi dvenemísitelné
  fáze
• stacionární fáze (pevná nebo kapalná)
• mobilní fáze (kapalná nebo plynná)
• Mobilní fáze unáší jednotlivé vzorky skrz
  stacionární fázirozdílnou rychlostí v závislosti
  na jejich afinite k fázím.

28

• pokud je afinita látky k mobilní fázi vysoká,
  látka putuje systémem rychleji než látka s nižší
  afinitou
• pokud je afinita látky ke stacionární fázi
  vysoká, látka je ve stacionární fázi déle
  zadržována a pohybuje se sytémem pomaleji než
  látka mající nižší afinitu

29
Obrázek prevzat z http//www.chemistry.vt.edu/chem
-ed/sep/lc/lc.html (listopad 2006)
30
(No Transcript)
31
Co je cílem analýzy?

1. rozdelit (separovat) od sebe jednotlivé látky
2. identifikovat látky ( kvalitativní analýza)
3. stanovit koncentraci prítomných látek
   ( kvantitativní analýza)

32
Klasifikace chromatografických technik

• podle mobilní fáze
• kapalinová chromatografie (LC)
• plynová chromatografie (GC)
• podle usporádání
• planární (rovinná) chromatografie
• chromatografie v kolone

33
kapalinová v kolone manuální chromatografie
34
kapalinová v kolone instrumentální chromatografi
e
35
príklad
kapalinová planární chromatografie
36
Plynová chromatografie (GC)
Obrázek prevzat z http//www.cofc.edu/kinard/221L
CHEM/ (listopad 2006)
37

• podle fyzikálne-chemických interakcí
• adsorpcní chromatografie
• rozdelovací chromatografie
• gelová permeacní chromatografie (GPC)
• chromatografie na iontomenicních (IONEX)
• afinitní chromatografie

38
Fyzikálne-chemické mechanismy separace
sítový efekt gelová chromatografie
adsorpce
rozpouštení
iontová výmena
specifická interakce- afinitní chromatografie
Snímek prevzat z prezentace analyticke_metody /
Petr Tuma
39
Obrázek prevzat z http//fig.cox.miami.edu/cmalle
ry/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)
40
Obrázek prevzat z http//fig.cox.miami.edu/cmalle
ry/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)
41
Obrázek prevzat z http//fig.cox.miami.edu/cmalle
ry/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)
42
Vyhodnocení chromatogramu
1) planární chromatografie (pr. TLC)
Porovnání skvrn se standardy Rf a /b Rf
retardacní faktor (rate of
flow) a vzdálenost start-stred skvrny b
vzdálenost start-celo mobilní f.
b
a
Obrázek prevzat z http//sms.kaist.ac.kr/jhkwak/g
c/catofp/chromato/tlc/tlc.htm (listopad 2006)
43
2) chromatografie v kolone (HPLC, GC)

• Porovnání píku se standardy
• tR retencní cas
• identifikace látek
• h výška píku
• ? koncentrace látek

píky
44
Chromatografie v praktickém cvicení

• TLC lipofilních barviv
• adsorpcní planární kapalinová chromatografie
• mobilní fáze toluen (nepolární)
• stacionární fáze desticka se silikagelem
  (polární)
• stadardy barviv ? porovnání Rf
• neznámý vzorek obsahuje 2 ruzná barviva

45
Demonstrace HPLC a GC

• HPLC
• High Performance Liquid Chromatography
  (vysokoúcinná kapalinová chromatografie)
• normální nebo reverzní fáze
• princip (vysokoúcinná, vysokotlaká chromatogr.)
• GC
• Gas Chromatography(plynová chromatografie)

46
(No Transcript)
47
Potenciometrie
potenciometr
48
PRINCIP

• Potenciometrie je elektrochemická metoda založená
  na merení napetí elektrochemického clánku za
  bezproudého stavu.
• dve elektrody
• indikacní (merící) elektroda
• referentní (srovnávací) elektroda

49
Schéma
50
Elektrody

• indikacní elektroda
• její potenciál závisí na složení roztoku
• referentní elektroda
• její potenciál je stabilní (konstantní, známý)
• Merit prímo potenciál jako takový nelze ? meríme
  rozdíl potenciálu (napetí)

51
indikacní elektrody
Obrázek prevzat z http//food.oregonstate.edu/imag
es/ph/beck8.jpg (2006)
52
Nernstova rovnice

• E E0 (RT/nF) ln aM
• E elektrodový potenciál
• E0 standardní elektrodový potenciál
• R molární plynová konstanta (8.314 J K-1 mol-1)
• F Faradayova konstanta (96 458 C mol-1)
• T absolutní teplota (25 0C 298 K)
• n náboj stanovovaného iontu (M)
• a aktivita stanovovaného iontu

53
E E0 (RT/nF) ln aM

• ln a 2.303 log a dosazeno za R, T a F ?
• E E0 (0.059/n) log aM
• ! DULEŽITÉ !
• elektrodový potenciál závisí na teplote roztoku,
  aktivite (koncentraci) a náboji stanovovaného
  iontu
• elektrodový potenciál nepotrebujeme pocítat ke
  kalibraci potenciometru používáme standardy

54
Obecná klasifikace elektrod

• elektrody I. druhu (kovové nebo plynové)
• elektrody II. druhu (kov jeho nerozpustná sul)
  ? REFERENTNÍ ELEKTRODY
• redoxní elektrody (Pt, Au)
• membránové elektrody ? ISE iontove
  selektivní elektr.
• (stanovení iontu v medicíne H, Na, K, Cl-,...)

55
Standardní vodíková elektroda (SHE)

• plynová elektroda
• její potenciál byl definován ESHE 0
• za
  všech podmínek

REFERENTNÍ ELEKTRODA, ale v praxi se bežne
nepoužívá
56
Referentní elektrody
kalomelová
argent-chloridová
SHE
57
Sklenená elektroda

• ISE (H)
• stanovenípH

membránová electroda
58
Membránové elektrody na stanovení plynu
59
elektroda používaná na stanovení CO2 v krvi
60
Potenciometrie v praktickém cvicení

• Merení pH fosfátového pufru
• roztoky fosfátového pufru o ruzném složení
• stanovení pH pomocí pH-metru
  ( upravený potenciometr)
• kalibrace prístroje pomocí standardu
• sklenená kombinovaná elektroda (dvojce)

61
Sklenená kombinovaná elektroda
62
Sklenená kombinovaná elektroda v praktiku
63
Volumetrie ( titrace, odmerná analýza)
64
Metoda založená na chemické reakci mezi
analyzovanou látkou a tzv. odmerným roztokem
titrace zjištení presné koncentrace vzorku
byretas odmerným roztokem
titracní banka s naredenýmanalyzovaným vzorkem
65
PRINCIP

• K analyzované látce se pomocí byrety postupne
  pridávároztok o známé koncentraci, a to tak
  dlouho, dokud není dosaženo stechiometrického
  pomeru reagujících látek ( bod ekvivalence)
• bod ekvivalence reagující látky jsou ve
  stechiometrickém pomeru daném chemickou rovnicí
  popisující probíhající reakci

66
Odmerný roztok (OR)

• známé, presne definované složení
• jeho koncentraci lze presne stanovit pomocí
  stadardu o známé a nemenné koncentraci
• reaguje se stanovovanou látkou rychle, bez
  vedlejších reakcí
• reakci lze popsat chemickou rovnicí
• v bode ekvivalence dochází skokemk
  fyzikálne-chemické zmene, kterou je možno snadno
  indikovat

67
Zjištení presné koncentrace OR

• titrací standardu o presne známé koncentraci
• porovnání teoretické (predpokládané, vypocítané)
  spotreby se skutecnou (aktuální, titrací
  zjištenou)
• Vt / Va f
• f faktor odmerného roztoku (0,900 1,100)
• aktuální konc. OR ( titr) ca f x ct
• faktorem pri výpoctu koncentrace vzorku násobíme
  teoretickou hodnotu koncentrace OR

68
Výpocet koncentrace vzorku

• založen na znalosti stechiometrie chemické reakce
• a A b B ? c C d D
• a, b, c, d stechiometrické koeficienty
  látkové množství (n)
• A odmerný roztok, B analyzovaná látka
• a / b n(A) / n(B)

69
a / b n(A) / n(B)

• c n / V ? n c x V
• c molární koncentrace (mol/l)
• n látkové množství (mol)
• V objem roztoku
• a, b stechiometrické koeficienty
• a x n(B) b x n(A)
• a x cB x VB b x cA x VA

70
a x cB x VB b x cA x VA

• známe stechiometrii chemické reakce
• známe koncentraci odmerného roztoku a jeho objem
  spotrebovaný pri dosažení bodu ekvivalence
• známe objem vzorku použitého pro analýzu
• jediná neznámá je koncentrace vzorku
• cB

71
Cvicení

• 1) spotreba odmerného roztoku 23,8 ml NaOH,(f
  0,9685 C 0,1M), vzorek 10ml H2SO4 C ?
• 2) spotreba odmerného roztoku 10ml KMnO4
  (0,1M), vzorek 20ml FeSO4 C ? (mol/ L, ),
• MW 152g
• 3) H3PO4 ? Na2HPO4 vzorek 20ml H3PO4 (C
  0,3M ), odmerný roztok 0,2M NaOH V ?

72
Titraci provádí jedna osobapo kapkách pridává
OR z byretyza stálého promíchávání obsahu
titracní banky
73
Indikace bodu ekvivalence

• pomocí indikátoru
• jednoduché, ale subjektivní hodnocení
• bod ekvivalence ? objemu OR po jehož pridání
  zmení titrovaný roztok trvale své zbarvení
• indikuje první nadbytecnou kapku pridaného OR
• ? ve skutecnosti je pri zmene zbarvení
  roztok pretitrován
• pomocí prístroje (napr. potenciometru)
• objektivní
• vyhodnocuje se TITRACNÍ KRIVKA

74
Titracní krivkatitrace kyseliny hydroxidem
merená velicina
indikátory
odmerný roztok
75
titrace hydroxidu kyselinou
odmerný roztok
76
Klasifikace titrací

• neutralizacní (acidobazické) kyselina /báze
• H OH- ? H2O
• oxidacne-redukcní (redox) ox./red. cinidlo
• oxidace red ? ox e-
• redukce ox ? red e-
• srážecí pr. AgNO3
• vznik nerozpustné sraženiny
• komplexometrické pr. EDTA
• vznik koordinacne-kovalentní slouceniny

77
Titrace v praktickém cvicení

• Stanovení acidity žaludecní štávy
• reaguje HCl ze žaludecní štávy
• odmerný roztok NaOH
• ? neutralizacní titrace ( alkalimetrie)
• indikátor fenolftalein (bezbarvý ? fialový)
• z konc. HCl se vypocítá pH žaludecní štávy
• zjištuje se pH pred a po stimulaci ( na
  lacno a po jídle)

78
Návody na praktika teorie metod

• http//www.lf3.cuni.cz/chemie/
• viz. Studium / praktika