Solubiologia 750121 (5 op)

1
Solubiologia 750121 (5 op)

• Seppo Saarela (eläintieteen osuus)http//cc.oulu.
  fi/ssaarela/sb.htm

2
Tentit ja muut suoritukset

• Kotitentti solun kemia, solubiologiset
  tutkimusmenetelmät, solubiologian historia
  (esseevastausten palautus vko 41 perjantai
  07.10.2011 klo 16 mennessä)
• Tentit (eläintieteen osuus) 1 vk. torstai
  20.10. klo 10-12 salissa L4, uusinta perjantai
  04.11. klo 14-16 salissa YB210

3
Mistä löytyy tietoa?

• Oppikirja Molecular Biology of the Cell
  Alberts, Bray, Johnson, Lewis, Raff, Roberts
  Waalter. Garland 2008http//www.garlandscience.co
  m/textbooks/0815332181.asp
• Molecular Cell Biology (6. painos) 2008 Lodish,
  Berk, Zipursky, Matsudaira, Baltimore Darnell.
  Freeman
• Solubiologia (2. painos) 2004, Jyrki Heino
  Matti Vuento. WSOY

4
Mistä löytyy

• Tieteelliset lehdet Cell, Nature, Science
• http//cc.oulu.fi/ssaarela/

5
Lähtötaso-oletus

• Kemian perustiedot oletetaan
• hankituiksi jo aiemmin
• Kemialliset reaktiot
• Solubiologian kannalta tärkeät yhdisteet

6
Plasma membrane
Peroxisome
Mitochondrion
Nucleus
Nucleolus
Rough ER
Smooth ER
Golgi apparatus
Lysosome
Nuclear pore
Cytoskeletal fibers
7
Kantasolukeksintö mahdollistaa henkilökohtaiset
soluvaraosat
Kantasolukeksintö mahdollistaa henkilökohtaiset
soluvaraosat

• Kari Alitalo Timo Otonkoski
• Helsingin Sanomat 20.9.2008

8
Sisältö 1

• Solubiologian opiskelusta
• Käytännön ohjeita solubiologian opiskeluun
• Solubiologian historia
• Solubiologian kannalta tärkeitä tiedemiehiä ja
  keksintöjä. Nämä asiat kuuluvat "hauska tietää"
  -kategoriaan.

9
Sisältö 2

• Solubiologiset tutkimusmenetelmät
• Solun kemia
• Solun rakenteen ja toiminnan kannalta tärkeät
  pienmolekyylit, makromolekyylit, epäorgaaniset ja
  orgaaniset yhdisteet.
• KOTITENTTI TÄHÄN SAAKKA!

10
Sisältö 3

• Solun rakenne ja toiminta
• SOLUKALVO
• Solukalvon kemiallinen koostumus ja hienorakenne
• Aineiden kulkeutuminen solukalvon läpi
• Solukalvojen erilaistumat ja solujen
  kiinnittyminen toisiinsa

11
Sisältö 4

• Endosytoosi
• Eksosytoosi
• Sytosoli ja solunsisäinen kalvosto Tärkeimpiä
  käsiteltäviä organelleja eläintieteen osuudessa
  ovat
• Endoplasmakalvosto
• Golgin laite

12
Sisältö 5

• Lysosomit 
• Peroksisomit
• Glyoksisomien rakenne ja toiminta opiskellaan
  kasvitieteen osuudessa.
• Kalvostojen liike

13
Sisältö 6

• Ribosomit ja valkuaisainesynteesi
• Energian virtaus ja energia-aineenvaihdunta
  soluissa
• Mitokondriot
• Energia-aineenvaihdunta

14
Sisältö 7

• Anaerobinen ja aerobinen soluhengitys
• Fototrooppinen energia-aineenvaihdunta
  käsitellään kasvitieteen osuudessa
• Solun tukiranka
• TumaAinoastaan tuman rakenne käsitellään tässä
  yhteydessä. Tuman merkitys solun toiminnan
  kannalta ja perinnöllisen informaation siirrossa
  käsitellään perinnöllisyystieteen osuudessa.

15
Sisältö 8

• Erilaistuneita soluja
• 1. Lihassolu
• 2. Hermosolu
• Signaalien välitysmekanismit
• 1. Sähköinen signaalinvälitys
• 2. Hormonit ja reseptorit
• Solujen erilaistuminen ja solukuolema

16
Mikä virhe pakinassa?

• Miksi Jeppe juo?
• Kuopiolaiset ovat löytäneet viinageenin!
• Ihmiset, joilta puuttuu geeneistään ihastuttava
  valkuaisaine nimeltään neuropeptidi Y, sortuvat
  jupotteluun.

Sanomalehti Kalevakesä 2000
17
Solujen vanheneminen

• Terveessä mitokondriossa happi sitoutuu
  oksidatiiviseen fosforylaatioon
• Vanhenemisen myötä ATPtä syntyy vähemmän ja
  vapaiden radikaalien osuus lisääntyy.

Scientific American 1997
18
Mitä kuva mahtaa esittää?
Mihin solurakenteisiin vapaat radikaalit
iskevät?
Scientific American 1997
19
Kysymyksiä

• Mistä solut tulevat?
• Miten organismit muodostavat sidoksia?
• Miten tulehtunut kudos nopeasti täyttyy
  valkosoluilla?
• Solujen alkuperän ymmärtäminen on tärkeää
  biologiassa ja lääketieteessä!

20
Mistä solut tulevat?

• Rudolf Virchow- lääkäri ja antropologi
• osoitti 1850-luvulla, että solut muodostu-vat
  aina toisista soluista

21
Solut eivät peräisin nonsellulaarisesta
materiaalista!

• Syöpäkudoksen nopea kasvu johtuu orga-nismin
  omien solujen kontrolloimattomas-ta
  jakautumisesta.
• Valkosolujen nopea kasautuminen tulehtuneeseen
  kudokseen on peräisin verenkierrosta.

22
Elävät organismit

• Saavat energiaa ympäristöstä
• Suorittavat kemiallisia reaktioita
• Muuttuvat ajan mukana
• Reagoivat ympäristöön
• Lisääntyvät

23
Voidaanko solu määritellä?

• Solu on kaikkien organismien pienin
  toiminnallinen yksikkö.
• Molekulaarisella tasolla kaikki solut
  muistuttavat toisiaan.
• Moderni solubiologia pyrkii selittämään ja
  etsimään ominaisuuksia soluorganellien ja
  pienempien solurakenteiden tasolla.

24
Solubiologian juuret
25
Historia 1

• Soluoppi eli sytologia (kreik. kytos kotelo)
• Robert Hooke (1665) cellula ( solu, suom.
  Lönnrot)
• 1674 van Leeuwenhoek- kuvasi useita solutyyppejä

26
Historia 2

• 1800-luku
• Schleiden ja Schwann (1838) Kaikki eläimet ja
  kasvit rakentuvat soluista
• Hertwig Uusi yksilö syntyy kahden solun
  yhteensulautumisesta
• Mendel (1865)

27
Historia 3

• 1900-luku
• Sumner (1926) Entsyymit ovat valku-aisaineita
• Beadle ja Tatum (1940) Mutaatiokäsite
• Averly (1944) DNA sisältää geneettisen
  informaation
• Watson ja Crick (1953) DNAn rakenne kaksoishelix

28
Historia 4

• 1950-luku
• elektronimikroskopia kehittyi (tosin keksittiin
  jo 1931) ? soluorganellit (Palade, Claude, de
  Duve 1974)
• 1980-luku
• yhdistelmä-DNA, DNAn emäsjärjestys (Berg,
  Gilbert, Sauger)

29
Historia 5

• Konfokaali- ja scanning-elektronimikroskooppi
  yleiseen käyttöön
• 1990-luku
• videotekniikka mikroskopoinnissa (Allen ja Inoue)
• transgeenisten eläinten tuottaminen
• Immunoblottaus, Northern, Western
• PCR, q-PCR (RT-PCR)
• 2000-luku
• geenisiru
• Genomiikka
• Transkriptomiikka
• Proteomiikka
• Fysiomiikka

30
Solubiologisia tutkimusmenetelmiä
31
(No Transcript)
32
Skaalaus
10m
Ihmisen pituus
1m
Eräiden hermo ja lihassolujen pituus
Mikroaallot (radio- aallot)
0.1 m
Kananmuna
1 cm
Sammakon muna
1 mm
Infrapuna (IR)
100 µm
Kasvi- ja eläinsolut
Näkyvä valo
10 µm
Tuma, bakteerit, mitokondrio
1 µm
UV-valo
100 nm
Mykoplasma, virukset
10 nm
Röntgensäteet
Ribosomit, pallomaiset proteiinit, lipidit
1 nm
Pienet molekyylit
?-säteet
33
Mikroskoopit

• Suurennus ja erotuskyky
• valomikroskooppi max 1000 x
• elektronimikroskooppi jopa 10 000 x
• tärkeämpi on resoluutio eli erotuskyky

34
Valomikroskoopin periaate

• Hooke, van Leeuwenhoek 1600-luku
• objektiivi yl. 10-100 x
• okulaari 4-16 x
• kondensori kohdistaa valon, useita osalinssejä
• suurennus obj x okul.

35
Valomikroskooppi
36
Resoluutio eli erotuskyky

• Resoluutio paranee, kun aallonpituus lyhenee tai
  objektiivin numeerinen apertuuri kasvaa

37
Resoluutio 2

• Objektiivin numeerinen apertuuri kasvaa, kun
  objektiivin avautumiskulma kasvaa
• Objektiiveja, joiden NA jopa 0.95

38
Resoluutio 3

• Immersioöljyä (taitekerroin sama kuin
  objektiivilla) käyttämällä objektiivin ja kohteen
  välissä taitekerroin paranee. NA voi olla jopa
  1.4
• Näin mikroskoopin erotuskyvyn max ? 1/3 käytetyn
  valon aallonpituudesta
• r ? 0.2 ?m ? mitokondriot voi erottaa pistemäisinä

39
Resoluutio 4

• Elektronivuon aallonpituus ? 10 pm ? erinomainen
  erotuskyky

40
Fluoresenssimikroskooppi

• Valonsäde valolähteestä kulkee ekskitaatiosuotimen
  kautta (musta viiva)
• Näytteen valaiseminen tämän valonsäteen avulla
  saa aikaan molekyylien fluoresenssin (elektronien
  virittyminen), emittoituu ja lähettää valoa
  pitemmällä aallonpituudella (sininen)

41
Fluoresenssimikroskooppi

• Näytteeseen kohdistetaan UV-valoa (360-400 nm)
• objektiivin jälkeen UV leikataan pois suotimella
  ? fluorisoiva aine näkyy vihreänä (fluorisoivat
  värit)

42
Fluoresenssimikroskopia 1

• Fluoresenssimikro-graafi osoittaa pitkien
  aktiinisyiden jakautumisen fibroblastisoluviljel-m
  ässä
• Ihmisen ihon fibroblasteja käsiteltiin ensin
  detergentillä ja sitten värjättiin antiaktiini
  antibodylla

43
Fluoresenssimikroskopia 2

• Hiiren lisäkives suurennus 1.25x40
• (Ahti Pyörnilä)

44
Fluoresenssimikroskopia 3

• Metsäsopuli (Myopus schisticolor), ruskea
  rasvakudos (BAT), suurennus 10x100x1.25 (Ahti
  Pyörnilä ja Seppo Saarela)

45
Fluoresenssimikroskopia 4
Osoittaa sympaattisten hermopäätteiden
(noradren-ergisten) esiintymisen

• Helmipöllön sydän Noradrenaliinin fluoresenssi,
  10x40x1.25 (Ahti Pyörnilä)

46
Fluoresenssimikroskopia 5

• Heat shock proteiinin ekspressoituminen C.
  elegans mutantissa.
• Fluoresenssiajastin
• Proteiini, joka vaihtaa väriä ajan funktiona

Terskikh et al. (2000) Science 24 Nov
47
Pimeäkenttämikroskooppi

• Vain kohteen rajapinnoista siroava valo
  päästetään ohjektiiviin
• Tumma tausta ? voidaan erottaa pienempiä kohteita

48
Faasikontrastimikroskooppi

• Vaihevastakohta-mikroskooppi
• Näytteen läpi kulkeneeseen valoon aiheutetaan
  1/4- aallon vaihe-ero ? yhdistetään sironneeseen
  valoon ? vaihe-erot muuttuvat amplitudieroiksi
• kontrasti kuvan osien välille

49
Faasikontrastimikroskooppi

• Optiikka
• Suora valo mustalla
• Näytteestä lähtenyt hajavalo punaisella

50
Interferenssimikroskooppi

• Kaksi sädettä näytteeseen ja näytteestä ohi
• Säteiden yhdistäminen ? vaihe-ero ? amplitudiero
• Muistuttaa faasikontrastia, mutta antaa
  3D-vaikutelman

51
Mikrograafeja

• Fibroblasti kudosviljelmässä
• Valomikroskopia ilman värjäystä
• Faasikontrastimikroskopia
• Interferenssikontrasti-mikroskopia
• Pimeäkenttämikroskopia

52
KONFOKAALIMIKROSKOPIA

• Konfokaalimikroskoopilla saadaan laservalo
  keskitetyksi hyvin tarkkaan yhdelle optiselle
  tasolle, jolloin sen pyyhkäisy antaa kuvan
  kyseisestä solutasosta.
• Ottamalla kuvia peräkkäisistä leiketasoista
  voidaan tiettyjen matemaattisten algoritmien
  avulla suodattaa kuvista pois kuvia vääristävä
  informaatio.
• Näin optimoitujen tasokuvien avulla voidaan
  seuraavaksi tehdä kohteesta kolmi-ulotteinen
  mallinnos, jota voidaan vapaasti pyörittää
  kaikissa suunnissa.

53
Biologian laitoksen konfokaalimikroskooppi
Zeiss LSM5 Pascal
Katja Anttila, 2004
Photo Joose Kankare
54
Vesikanava
Rotan jalkapohjan poikkijuovainen lihassolu
Mika Kaakinen, 2004
55
Vesikanava kaksoisvärjäyksellä
Vesikanava näkyy vihreänä
Z-levyn prot. näkyy punaisena
Mika Kaakinen, 2004
56
Elektronimikroskooppi

• Valolähteenä elektronisuihku (katodisädeputki),
  jännite 1-100 kV ? vaikuttaa aallonpituuteen ja
  erotuskykyyn
• Linsseinä magneetit
• Kuva syntyy fluorisoivalle kalvolle (vrt. TV)
• TEM eli transmissio-EM, läpivalaisuelektronimikros
  kooppi- leikkeet- elektronien absorptio

57
Pyyhkäisy-EM (SEM)

• Scanning-EM
• Soveltuu pintojen kuvaamiseen
• Ei linssejä
• Kuva muodostuu piste pisteeltä suihkun
  pyyhkiesssä (scanning) näytteen pintaa
• Syntyy sekundaarielektroneja

58
Scanning electron microscope

• Pyyhkäisyeletronimikros-kooppi
• Kuva syntyy sekundaari-elektronien avulla, jotka
  emittoituvat näytteeseen
• Vahvistetaan tuikekiteen ja vahvistimen avulla ?
  monitorille
• Näytteen pinta päällys-tetään esim. kullalla

59
Valo- ja elektronimikroskoopin optiset
järjestelmät

• Valomikroskooppi käyttää näkyvää valoa ja
  linssejä kuvanmuodostukseen
• Kuva silmän verkkokal-volle, filmille tai
  video-kuvaksi sähköiseen muotoon
• EM käyttää elektroni-suihkua, joka emittoituu
  fluorisoivalle kalvolle tai filmille

60
Elektronimikroskoopit (TEM, SEM)

• Vasemmalla TEMn periaate ja oikealla SEMn
  periaate
• TEMn periaate muistuttaa valomikroskooppia
• SEMssä näytettä pommitetaan elektroneilla ja sen
  jälkeen mitataan niiden sirontaa näytteen pinnasta

61
SEM-kuva

• Kesykyyhkyn väive
• Näytettä on rutisteltu pinseteillä!

Photo Riitta Harjula
62
SEM-kuva

• Potnapekan pää

Riitta Harjula
63
SEM-kuva

• Ampiaisen jalan karvoja

64
SEM-kuva

• Kirva

65
Paramecium eri mikroskoopeilla kuvattuna
Valomikroskoopissa
SEM
66
Paramecium

• Elektronimikroskoop-pikuva (TEM)

67
Analyyttinen-EM

• Alkuaineiden pitoisuudet näytteistä

68
High Performance Liquid Chromatography
Photo Joose Kankare
69
Tehokkaat sekvensointilaitteet

• Mahdollista saada jopa yhdessä 9 tuntia
  kestävässä ajossa tietomäärä, jonka kokoaminen
  aiemmilla järjestelmillä vei vuosia (vrt. esim.
  ihmisen genomiprojekti)
• Soveltuu laajojen näyteaineistojen käsittelyyn
• Auttaa esim. sellaisten diagnostisten
  markkeriyhdistelmien valinnassa, jotka kuvaavat
  hyvin varhaisia vaiheita sairauksien
  kehittymisessä - metabolinen oireyhtymä -
  sydän- ja verenkiertoelimistön sairauksien
  alkuvaiheet

70
Tehokkaat sekvensointilaitteet

• Erikoistarpeita OYssa
• erilaiset näytemateriaalit, kasvi, eläin,
  mikrobi, humaani, solulinja, DNA, RNA, koko
  genomi,
• valitut geenialueetRoche