Zastosowania mAb

1

• Zastosowania mAb
• Badania naukowe (wykrywanie róznych zwiazków,
  obrazowanie, lokalizacja, oczyszczanie,
  okreslanie stezenia etc.) (ELISA, RIA, Western
  blotting, cytometria przeplywowa, barwienie
  immunocytochemiczne)
• Biotechnologia (abzymy, chromatografia
  powinowactwa)
• Diagnostyka
• Terapie

2
Swiatowy rynek przeciwcial monoklonalnych
stosowanych w diagnostyce i terapiach 2004 11
200 000 000 i planowano 2010 26 000 000 000

W rzeczywistosci 2007 27 000 000 000 2008
33 000 000 000 2010 gt 40 000 000 000
3
Nazwa producenta
Nazwa handlowa
Cel
CD3
Muromonab
OKT3
VLA4 (l. alfa)
Natalizumab
Tysabri
CD20
Rituximab
Rituxan
IL2Ra
Basiliximab
Simulect
IL2Ra
Daclizumab
Zenapax
TNF
Infliximab
Remicade
TNF
Adalimumab
Humira
wirus RSV
Palivizumab
Synagis
HER2
Trastuzumab
Herceptin
EGFR (HER1)
Cetuximab
Erbitux
IgE
Omalizumab
Xolair
VEGF
Bevacizumab
Avastin
4
Przeciwcialo Przeciwcialo Antygen Akcept.
1 Muromonab OKT-3 CD3 1986
2 Abciximab        ReoPro      CD3 1994
3 Rituximab       Rituxan      CD20 1997
4 Daclizumab Zenapax IL-2Ra 1997
5 Infliximab        Remicade  TNF 1998
6 Trastuzumab Herceptin   HER2 1998
7 Palivizumab  Synagis      RSV 1998
8 Basiliximab Simulect IL-2Ra 1998
9 Alemtuzumab Campath CD52 2001
10 Adalimumab Humira       TNF 2002
11 Ibritumomab tiuxetan Zevalin CD20 2002
12 Omalizumab    Xolair         IgE 2003
13 Efalizumab   Raptiva      CD11a 2003
14 Tositumomab Bexxar CD20 2003
15 Cetuximab       Erbitux       EGFR 2004
5
Przeciwcialo Przeciwcialo Antygen Akcept.
16 Bevacizumab    Avastin Lucentis  VEGF 2004 2006
17 Natalizumab   Tysabri a4-integrin 2004
18 Ranibizumab Lucentis    VEGF 2006
19 Panitumumab Vectibix    EGFR 2006
20 Eculizumab Soliris C5 (dopel.) 2007
21 Certolizumab Cimzia      TNF 2008
22 Tocilizumab Actemra   IL6R 2008
23 Ustenkinumab Stelara      IL12/IL23 2008/9
24 Golimumab Simponi TNF 2009
25 Ofatumumab Arzerra CD20 2009
26 Canakinumab Ilaris IL-1a 2009
27 Denosumab Prolia RANKL 2010
28 Brentuximab vedotin Adcetris CD30 2011
29 Belimumab Benlysta BLyS 2011
30 Ipilimumab Yervoy CTLA-4 2011
6
Przeciwcialo Przeciwcialo Antygen Akcept.
31 Mogamulizumab Poteligeo CCR4 2012
32 Pertuzumab   Perjeta HER2 2012


7
Kto i kiedy po raz pierwszy zastosowal w terapii
przeciwciala?? Nie byly to jeszcze przeciwciala
monoklonalne, a odkrywca terapii nie wiedzial, ze
to co dziala to sa przeciwciala!
8
Emil von Behring 1854 - 1917
Pierwsza Nagroda Nobla w dziedzinie fizjologii i
medycyny 1901 "for his work on serum therapy,
especially its application against diphtheria,
by which he has opened a new road in the domain
of medical science and thereby placed in the
hands of the physician a victorious weapon
against illness and deaths"
Ciekawostka Emil von Behring urodzil sie w
miejscowosci Hansdorf obecnie Lawice w woj.
warminsko-mazurskim.
9
Shibasaburo Kitasato pracowal reka w reke z
Behringiem, ale Nobla nie dostal
10

• Emil von Behring pracowal nad stosowaniem
  surowic przeciw tezcowi i przeciw blonicy
• Wprowadzil pojecie antytoksyna
• 1893 pierwsze próby leczenia blonicy u ludzi
  uwienczone sukcesem

http//history.nih.gov/exhibits/history/assets/ima
ges/antitoxin_lg.jpgimgrefurl
11
Struktura IgG1
CDR regiony hiperzmienne albo regiony
determinujace dopasowanie
12
http//www.spaltudaq.com/files/JPEG20of20Antibod
y.JPG
13
Fragmenty zmienne VL i VC (niebieskie)
przeciwciala monoklonalnego anty-lizozym
oddzialujace z antygenem (lizozym zielony)
14
(No Transcript)
15
Z czego wynika zmiennosc przeciwcial?
Susumu Tonegawa (lata 80) Nagroda Nobla (1987)
za odkrycie genetycznych podstaw róznorodnosci
przeciwcial
16
Budowa genów kodujacych lancuchy lekkie i ciezkie
immunoglobulin czlowieka
17
Rekombinacja VDJ segmentów lancucha ciezkiego
RAG1 i RAG2 sa zaangazowane w ten proces RAG
(ang. Recombination Activating Genes)
18
Fragment zmienny lancucha ciezkiego
Region CDR3 charakteryzuje sie najwieksza
zmiennoscia
19
Podczas procesu rekombinacji fragmentów genów
kodujacych lancuchy immunoglobulin dochodzi do
utraty czesci materialu genetycznego. Genom
dojrzalej komórki B jest ubozszy o fragmenty DNA
od innych komórek organizmu. Analogiczny
mechanizm jest znany jedynie przy
kombinatorycznym skladaniu genów kodujacych
lancuchy receptora limfocytów T (TCR)
20
Róznicowanie komórek B obejmujace rearanzacje
genów Ig zachodzi w szpiku kostnym. Szpik
opuszczaja komórki B charakteryzujace sie
ekspresja IgM na powierzchni komórek (IgM
stanowi podstawowa czesc BCR)
opuszcza szpik
21

• Dalsze róznicowanie komórek B zachodzi we
  wtórnych tkankach limfatycznych
• (sledziona, wezly chlonne)
• Wymaga interakcji komórek B z aktywowanymi
  limfocytami Th2
• Dwa procesy zachodzace podczas róznicowania to
• dojrzewanie przeciwcial czyli
• zwiekszanie ich powinowactwa w
• wyniku somatycznych hipermutacji
• zmiana klasy przeciwciala
• (class switch, isotype switch)

22
C.A. Janeway i wsp. Immunobiology
23
Przelaczanie klas
Cytokiny wplywaja na przelaczanie klas. Na
przyklad u myszy
cytokina izotyp
IL-4 IgG1, IgE
IFN-g IgG3, IgG2a
TGF-b IgG2b
24
Immunoglobuliny róznych klas róznia sie od siebie
aktywnosciami
IZOTYP IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Aktywacja dopelniacza -
Wiazanie z FcRg -
Przechodzenie przez lozysko tak nie tak tak
Klasy Ig mysich (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3) nie
odpowiadaja klasom Ig czlowieka.

• Wszystkie mysie IgG przechodza przez lozysko.
• Wszystkie mysie IgG z wyjatkiem IgG1 aktywuja
  dopelniacz.
• Wszystkie mysie IgG z wyjatkiem IgG3 wiaza sie
  z FcRg.

25
Jakie znaczenie ma to, ze przeciwciala zbudowane
sa z lancuchów lekkich i ciezkich?
Czy mozna sobie wyobrazic przeciwciala zlozone z
jednego typu lancuchów?
26
Przeciwcialo ludzkie
Przeciwcialo wielblada
Pierwsze doniesienia w 1997 roku
nanocialo (nanobody) hit biotechnologii
27
CO TO SA PRZECIWCIALA POLIKLONALNE? CO TO SA
PRZECIWCIALA MONOKLONALNE? CZYM SIE RÓZNIA?
28
(No Transcript)
29
(No Transcript)
30
Przeciwciala poliklonalne to po prostu
mieszanina przeciwcial monoklonalnych
31
(No Transcript)
32
Co moga rozrózniac mAb, czego nie moga rozrózniac
przeciwciala poliklonalne
Przyklady

• Dojrzala forme bialka od probialka
• Zmutowana forme bialka
• Specyficzne potranslacyjne modyfikacje
  (fosforylacja, glikozylacja itp.) dotyczace
  konkretnego bialka

33
Przyklad immunoprecypitacja chromatyny (z
pracy dr Anety Kaszy)
Badano promotor genu PAI-1. Komórki poddawano
dzialaniu róznych czynników. Stosujac
przeciwciala anty-Elk-1 stwierdzono, ze
niezaleznie od stymulacji tyle samo czynnika
transkrypcyjnego jest zwiazane z promotorem.
Stosujac przeciwciala rozpoznajace ufosforylowany
epitop Elk-1 stwierdzono, ze czynnik dodany do
próbki komórek 3 powoduje fosforylacje Elk-1.
34
Specyficznosc mAb
mAb sa specyficzne w stosunku do epitopu Jesli
dany epitop jest unikalny tzn. wystepuje tylko
w danym antygenie, to mAb bedac specyficznymi w
stosunku do danego epitopu sa równoczesnie
specyficzne w stosunku do antygenu Jesli epitop
nie jest unikalny, np. jest charakterystyczny dla
rodziny bialek, wtedy mAb nie jest specyficzne w
stosunku do antygenu
35
Przeciwciala monoklonalne moga byc w pelni
scharakteryzowane (sekwencja aminokwasowa,
struktura). Sa molekulami zdefiniowanymi. Przeciw
ciala poliklonalne, jako mieszanina róznych
bialek, nie daja sie w pelni scharakteryzowac.
36
PRZECIWCIALA MONOKLONALNE     ZALETY
WADY Specyficzne
Ograniczona -epitop
specyficznosc -bialko?
-bialko   Wysoce
Róznorodnosc pod zdefiniowane
wzgledem cech
fizykochemicznych
i biologicznych  
Nizsza czulosc w

niektórych testach  
37
Jak zrobic mAb?
38
(No Transcript)
39
Cesar Milstein i Georges J. F. Köhler   W
1975 opracowali metodyke uzyskiwania przeciwcial
monoklonalnych W 1984 roku Nagroda Nobla
  for theories concerning the specificity in
development and control of the immune system and
the discovery of the principle for production of
monoclonal antibodies.   Niels K. Jerne
równiez uhonorowany (za teorie sieci
immunologicznych)
   
40
(No Transcript)
41
Procedura uzyskiwania przeciwcial
monoklonalnych Immunizacja zwierzecia wybranym
antygenem Izolacja sledziony i uzyskanie
splenocytów immunizowanego zwierzecia Fuzja
splenocytów z komórkami szpiczaka (komórkami
nadajacymi uzyskanym hybrydom ceche
niesmiertelnosci) Selekcja zniszczenie
wszystkich komórek oprócz komórek hybrydoma
Testowanie wybranie tych hodowli hybrydoma,
które produkuja pozadane przeciwciala Klonowanie,
testowanie, subklonowanie, testowanie uzyskanie
pojedynczych klonów produkujacych pozadane
przeciwciala Namnazanie wybranych klonów Izolacja
przeciwcial z pozywki hodowlanej lub wysieku
otrzewnowego myszy
42
JAKIE POPULACJE KOMÓREK MOZNA ZNALEZC PO
FUZJI

•  
• komórki szpiczaka, które nie ulegly fuzji
• komórki B, które nie ulegly fuzji
• komórki hybrydowe
• zle
• dobre - k. szpiczaka x komórka B
•  
• zle to np. 2 k. szpiczaka x komórka B
• k. szpiczaka x 2 komórki B
• k. szpiczaka x k. szpiczaka
• komórka B x limfocyt T itd.
•  
• dobre komórki hybrydoma stanowia zaledwie 10- 4
  powstalych hybryd

43
JAKIE CECHY POWINNA POSIADAC LINIA SZPICZAKA
UZYTA DO FUZJI ?

• nie powinna produkowac wlasnych Ig (ani
  ciezkiego, ani lekkiego lancucha)
• powinna miec defekt enzymatyczny pozwalajacy na
  selekcje komórek hybrydoma
• powinna latwo ulegac fuzji a w wyniku fuzji
  powinny powstawac komórki stabilne, o duzej
  zywotnosci i stosunkowo szybko dzielace sie
• powinna pozwalac na wydajna synteze mAb

44

• SELEKCJA
• Po to, aby dobre komórki hybrydoma mogly zyc i
  namnazac sie komórki szpiczaka musza zginac!!!
• Do fuzji uzywa sie komórek szpiczaka z defektem
  genetycznym w syntezie nukleotydów.
• Istnieja dwa szlaki syntezy nukleotydów glówny
  i poboczny (ratunkowy ang. salvage pathway)

45

• Szlak glówny
• substraty do produkcji pirymidyn
• wodoroweglan, asparaginian, glutamina
• substraty do produkcji puryn wodoroweglan,
  asparaginian,
• glutamina, glicyna, mrówczan (z
  formylotetrahydrofolianu)

46
orotydynofosforan
47
REZERWOWE SZLAKI SYNTEZY NUKLEOTYDÓW
PURYNOWYCH   5-fosforybozylo-1-pirofosforan
PRPP
fosforybozylotransferaza adeninowa 
?
adenina PRPP ? AMP PPi
fosforybozylotransferaza hipoksantynowa 
? hipoksantyna PRPP ? IMP
PPi   guanina PRPP ? GMP
PPi   hypoxanthine phosphoribosyltransferase
(HPRT), (HGPRT)  
48
REZERWOWY SZLAK SYNTEZY dTMP
kinaza tymidynowa
deoksytymidyna ATP dTMP
ADP
49
Najczesciej stosowane do fuzji szpiczaki maja
defekt w genie HPRT.
Komórki bez HPRT (szpiczak) nie wykorzystaja
substratów szlaku pobocznego i zgina Komórki z
aktywnym HPRT (hybrydoma) wykorzystaja substraty
szlaku pobocznego i przezyja
50
Na czym polega hamowanie szlaku glównego przez
aminopteryne
Aminopteryna jest inhibitorem kompetycyjnym
reduktazy dihydrofolianowej N10 -
formylotetrahydrofolian uczestniczy w syntezie
puryn N5, N10 - metylenotetrahydrofolian
uczestniczy w syntezie TMP.
51

• SELEKCJA
• do fuzji uzywamy komórek szpiczaka z defektem
  genu HPRT (HPRT -)
• do pozywki dodajemy AMINOPTERYNE ? zahamowanie
  syntezy IMP oraz dTMP
• do pozywki dodajemy TYMIDYNE ? umozliwia to
  synteze TTP
• do pozywki dodajemy HIPOKSANTYNE ? umozliwia to
  synteze puryn komórkom majacym aktywna
  fosforybozylotransferaze hipoksantyny (HPRT)
• Komórki bez aktywnego HPRT ( komórki szpiczaka,
  które nie ulegly fuzji) gina.
• POZYWKA SELEKCYJNA TO POZYWKA H A T
• (Hipoksantyna, Aminopteryna, Tymidyna)

52
KTO WYMYSLIL SELEKCJE HAT ?
53
Waclaw Szybalski Bioessays. 1992
Jul14(7)495-500. Use of the HPRT gene and the
HAT selection technique in DNA-mediated
transformation of mammalian cells first steps
toward developing hybridoma techniques and gene
therapy. To artykul historyczny, wspomnieniowy.
54
W. Szybalski In 1956, I decided to apply my
experience in microbial genetics to developing
analogous systems for human cell lines, including
the selection of mutants with either a loss or
gain of a biochemical function. For instance,
mutants resistant to azahypoxanthine showed a
loss of the HPRT enzyme (hypoxanthine
phosphoribosyl transferase), whereas gain of the
same enzyme was accomplished by blocking de novo
purine biosynthesis with aminopterin, while
supplying hypoxanthine and thymine (HAT
selection). Using HAT selection, we (i)
genetically transformed HPRT- mutant cells to
HPRT wild type by using DNA extracted from HPRT
cells, and (ii) selected HPRT hybrid cells by
fusing HPRT- D98/AH2 cells with skin cells. These
approaches, which we dubbed in 1962 as a 'first
step toward gene therapy', contributed to the
later development of (i) cell fusion techniques,
(ii) the development of monoclonal antibodies,
(iii) routine transformation of mammalian cells
with cloned genes, and (iv) methods for creating
transgenic organisms.
55

• ELIMINACJA REWERTANTÓW
• Z HODOWLI SZPICZAKA
• W hodowlach szpiczaka zachodza z dosc istotna
  czestoscia (10-5/generacje) mutacje prowadzace do
  uzyskania przez komórki z powrotem aktywnego genu
  kodujacego HPRT
• Pojawienie sie takich rewertantów stanowi
  zagrozenie, gdyz nie pozwala na eliminacje
  komórek szpiczaka po fuzji
• Aby usunac z hodowli ewentualne rewertanty
  hoduje sie komórki szpiczaka z defektem HPRT w
  obecnosci
• 8-azaguaniny
• Ten analog guaniny jest rozpoznawany jako
  substrat przez HPRT
• Nukleotyd zawierajacy 8-azaguanine wbudowany w
  DNA zaburza jego strukture, co prowadzi do
  smierci komórek
• Komórki, które maja aktywny enzym HPRT (a wiec
  rewertanty) gina w obecnosci 8-azaguaniny
• Zwiazek ten nie jest toksyczny dla komórek,
  które nie maja aktywnego enzymu HPRT, gdyz
  komórki te nie sa w stanie wykorzystac
  8-azaguaniny do syntezy nukleotydu