The Shortest Telomere, Not Average Telomere Length, Is Critical for Cell Viability and Chromosome Stability

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The Shortest Telomere, Not Average Telomere
Length, Is Critical for Cell Viabilityand
Chromosome Stability

• Michael T. Hemann, Margaret A. Strong,
• Ling-Yang Hao, and Carol W. Greider

Presentación Cinalli, Alejandro Holgado, María
Pía Salvatierra, Damiana Scazzina, Brenda
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Telómeros

• Son estructuras especializadas presentes en las
  terminaciones naturales de los cromosomas, que
  permiten la estabilidad cromosómica (Repetición
  TTAGGG)
• Mantienen su longitud por un equilibrio
  acortamiento-elongación.

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Qué determina la pérdida de función telomérica?

• En ausencia de telómeros con un largo adecuado
  se observan fusiones cromosómicas (final con
  final), arresto del ciclo celular y apoptosis en
  células germinales (infertilidad).

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Qué dispara la respuesta celular?

• Dos hipótesis
• El promedio de la longitud telomérica
• El telómero más corto

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OBJETIVOS

• Determinar si la respuesta celular se dispara por
  un promedio de longitud telomérico bajo, o si se
  debe a la presencia individual de telómeros muy
  cortos.

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Modelo animal

• mTR murine telomerase RNA (templado para la
  síntesis del telómero)

Ratones mTR -/-
no presentan el RNA que sirve como templado
no tienen actividad telomerasa
Inicialmente (G1) no presentan fenotipo, en
generaciones más tardias (ej G4) los telómeros
son más cortos y hay eventos de fusión
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Los telómeros cortos inician una rta celular en
ratones mTR -/-
mTR /-
mTR-/- (G6) Telómeros cortos
X
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TUNEL - TdT- mediated dUTP nick end labelling
Daño al DNA- roturas de cadenas por cortes con
endonucleasas
Apoptosis
TdT transfiere dUTP biotinilado
Detección por streptoavidina-HRP
Incubación con DAB
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• mTR/- y mTR-/- G3 no muestran infertilidad y sus
  niveles de apoptosis de células germinales o
  fusión de cromosomas son los de un wild-type.
• mTR-/- G6 es generalmente no fértil

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• mTR-/- (iF1) presentó valores similares a los de
  un mTR-/- G6.
• mTR/- (iF1) mostró los mismos resultados que un
  wild-type.
• Esto indica que el agregado de la telomerasa
  rescató a este fenotipo. Y que la respuesta
  celular se debe a la presencia de telomeros
  cortos.

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Elongación preferencial de telómeros cortos en
ratones mTR/- (iF1)

• Se comparó la distribución de longitudes de los
  telómeros de mTR/- (iF1) y mTR-/- (iF1), con
  mTR/-, mTR-/- G3 y mTR-/- G6 usando
  Q-FISH.
• La longitud del telómero esta representada como
  unidades teloméricas fluorescentes (TFUs).
• El resultado se expresó como distribución de
  frecuencias de TFUs.

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Q-FISH

• Mide el largo individual de los telómeros
• Células arrestadas en metafase teñidas con sonda
  fluorescente específica de telómeros.
• Tinción con DAPI para visualizar cromosomas.
• Medición cuantitativa de la señal fluorescente
  para determinar largo de telómeros.

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• Se ve un cambio significativo en el promedio
  entre mTR/- y mTR-/- G3. Pero la diferencia fue
  mínima entre mTR -/- G3 y los mTR (iF1s).
• Entre mTR/- (iF1) y mTR-/- (iF1) se vio una
  diferencia en el número de telomeros muy cortos.
• Esto mostraría que la función telomérica se
  restaura por la adición de repeticiones a los
  telómeros mas cortos y no por una elongación
  global.

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La restitución de la actividad de telomerasa
ocurre temprano en el desarrollo

• Fibroblastos embrionarios (MEFs) de ratones mTR
  -/- (iF1) y /- (iF1) de 13,5 días de gestación.

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de terminaciones de telómeros sin repeticiones
teloméricas (signal free ends)
Análisis citogenético número de fusiones por
metafase
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Estudio de la sensibilidad a la radiación
ionizante
- Irradiar con Cs137 ? radiación beta y gamma -
Medir viabilidad con azul de tripan
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• La telomerasa restituye las repeticiones en los
  /-

Probablemente la telomerasa sea dirigida
específicamente a telómeros cortos y
disfuncionales
Reclutamiento por proteínas que reconocen
telómeros disfuncionales?
Reclutamiento por proteínas ausentes?
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Existe una distribución no azarosa de las
fusiones entre cromosomas en una línea de ratones
mTR -/-

• SKY
• (Spectral Karyotype- Cariotipo espectral en
  colores)
• Q-FISH
• (Quantitative fluorescence in situ hybridization)

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SKY
- Análisis de todos los cromosomas de un
organismo simultáneamente, cada uno de ellos se
encuentra marcado con un color diferente
- Se usan sondas de DNA fluorescentes que emiten
entre los 200 y 700 nm
- La discriminación por el color se consigue por
medio del análisis espectral de las señales
fluorescentes
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SKY (Spectrl Karyotype) en esplenocitos de mTR -/-
SKY Fusión de cromosomas 19 por los brazos P
Tinción con DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole)
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Cromosoma 19 12 de 14 Cromosoma 5 10 de
14 Cromosomas 3, 9, 10 e Y sin eventos de fusión
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Los cromosomas que frecuentemente están
involucrados en fusiones son los de telómeros más
cortos
Metafases de mTR-/- G6
Q-FISH Para determinar qué telómeros no emitían
señal
SKY Para determinar la identidadde los cromosomas
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Los cromosomas que frecuentemente están
involucrados en fusiones son los de telómeros más
cortos
Un cromosoma con extremo libre de señal tiene
mayor probabilidad de fusión que un cromosoma
conteniendo repeticiones teloméricas
Análisis estadístico
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Los cromosomas que frecuentemente están
involucrados en fusiones son los de telómeros más
cortos
El telómero más corto es el más propenso a
perder función y sufrir fusión con otro telómero
corto
Esto sugiere que es necesaria la presencia de dos
telómeros cortos para que se dé un evento de
fusión en la célula
Estudios en células humanas
El cromosoma 17 podría estar involucrado más
frecuentemente en rearreglos
El telómero en 17p es normalmente más corto que
los otros
La ubicación de p53 en 17p contribuiría a la
frecuente pérdida de p53 en los tumores humanos
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No hay secuencia telomérica presente en las
uniones de la fusión en ratones mTR-/- G5-G6
Estudios previos
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No hay secuencia telomérica presente en las
uniones de la fusión en ratones mTR-/- G5-G6
Clonado por PCR de la zona de la fusión
mTR-/- G5-G6
Wild-type
Se generaronproductos específicos
No se generaron productos específicos
Secuenciación
La unión consistía en 2 pequeñas secuencias
satélite fusionadas directamente
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No hay secuencia telomérica presente en las
uniones de la fusión en ratones mTR-/- G5-G6
Ninguna unión mostró secuencias de repetición
telomérica
Todas mostraron secuenciasde microhomología
Características de eventos de fusióndados por
mecanismos NHEJ (non-homologous end joining)
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No hay secuencia telomérica presente en las
uniones de la fusión en ratones mTR-/- G5-G6
FISH
Todas las fusiones mostraron una señal disminuida
en relación a satélites normales
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Una línea independiente de ratones mTR -/-
presenta diferentes telómeros cortos y diferentes
fusiones cromosómicas.

• Cada línea se establece por eventos al azar
  durante la fertilización inicial.
• La distribución de telómeros cortos vs las
  fusiones observadas no fue azarosa,
• ocurre lo mismo en otras líneas?

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Linea 2

• El resultado es una distribución no azarosa de
  longitudes teloméricas respecto de las fusiones
  pero los cromosomas cortos involucrados son
  distintos.

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Las longitudes teloméricas en ratones wild-type
no son cromosoma específicas.

• SKY y Q-FISH distribución de las longitudes
  teloméricas para cromosomas individuales.
• Análisis estadístico comparación entre la
  distribución longitudes de cada telómero y las
  demás distribuciones para el resto de los
  cromosomas.

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• No hay ningún final cromosómico que tenga una
  distribución de longitudes teloméricas cortas más
  reproducible que otros telómeros en ratones
  wild-type.

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Conclusión

• No es la longitud promedio de los telómeros la
  que gatilla la respuesta celular, sino la
  presencia de telómeros individuales con
  longitudes muy cortas.

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• La presencia de telomerasa rescata los fenotipos
  con telómeros disfuncionales.

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• El rol esencial de la telomerasa no sería el
  mantenimiento del promedio del largo de los
  telómeros, sino el mantenimiento de la función de
  los mismos, cuando alcanzan un largo mínimo
  crítico.

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• No hay telómeros que presenten tendencia a ser
  más cortos, pero sí los telómeros más cortos
  originan fusiones cromosómicas (final con final).