Estudo gen

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Estudo genético de populações de Aedes aegypti
(diptera culicidae) do sul do Brasil, pela
técnica de RAPD-PCR Área Biológica
Murilo Fernandes Pedroso, PIBIC (CNPq) Curso de
Ciências Biológicas, Campus Tubarão Orientadora
Drª Onilda Santos da Silva
Introdução A dengue tem sido considerada a
arbovirose humana de maior importância
epidemiológica, pois afeta 56 países no mundo
(WHO, 2002). Segundo o Ministério da Saúde
(2008), de janeiro a março foram registrados
120.413 casos de dengue clássica, 647 casos de
febre hemorrágica da dengue e 48 óbitos. O
principal transmissor dessa arbovirose ao homem é
o Aedes aegypti. A dispersão desse mosquito
ocorre através do vôo dos adultos, e no Brasil, o
transporte passivo de ovos, larvas e adultos, por
via rodoviária, também propicia a disseminação
desta espécie para todas as regiões. Um estudo
sobre o fluxo gênico dessas populações de Ae.
aegypti poderia fornecer indicativos sobre uma
possível variação genética da espécie. Desta
forma, seria possível predizer se há isolamento
genético ocasionado pela distância das populações
do sul do Brasil em relação ao resto país, ou se
são espécimes recentemente introduzidos de
regiões endêmicas de dengue, o que possibilitaria
grandes epidemias também nessa região do país.
Poderia-se discutir também se essa diferença ou
semelhança genética nas populações da região sul,
em relação a outras do país, pode influenciar no
modo como os mosquitos podem ter habilidade de
transmitir a arbovirose. Assim, este estudo
visa contribuir para um melhor entendimento sobre
fluxo gênico em populações de Ae. aegypti da
região sul do país, bem como servir de base para
futuros estudos com esta ou outras técnicas de
biologia molecular. Objetivos Geral Estudar
diferenciações genéticas em populações de Aedes
aegypti de diferentes regiões do sul do Brasil,
usando marcadores genéticos pela técnica de
RAPD-PCR. Específicos - Comparar geneticamente
as populações da região sul do Brasil - Comparar
geneticamente as populações da região sul com
outras de zonas endêmicas do país, como Rio de
Janeiro e Recife - Descrever os padrões de
diferenciação ou similaridade das populações de
Ae. aegypti das diferentes regiões do Brasil -
Entender os padrões de infestação desses
mosquitos nas diferentes regiões do sul do
Brasil. Metodologia Para a
realização do estudo, utilizou-se larvas de Aedes
aegypti obtidas através das Secretarias de Saúde
dos estados de Santa Catarina, Rio Grande do Sul
e Paraná. A metodologia para extração
de DNA baseou-se no protocolo de extração de DNA
de mosquito (Cheung et al., 1993 modificado por
Roseli Wassen). Sendo assim, macerou-se uma larva
de cada cidade em microtubo de 1,5 mL contendo
160µL de tampão de extração (Tris-HCl 200mM
pH8,0, NaCl 2M, EDTA 70mM. Em seguida,
adicionou-se 20µL de SDS 10 e submeteu-se o
macerado a incubação por uma hora, a 60ºC.
Após resfriamento a temperatura ambiente,
foram adiconados 50µL de clorofórimio álcool
isoamílico (241) e o produto foi centrifugado
por quinze minutos, a 13.000 rpm. Transferiu-se o
sobrenadante para um novo microtubo, ao qual
adicionou-se 80µL de acetato de amônio 7,5M e
300µL de etanol 96, homogeinizando as amostras
por inversão. A solução foi novamente
encubada, por duas horas a -20ºC, e em seguida
centrifugada a 13.000 rpm por vinte minutos. O
sobrenadante foi descartado e o precipitado
lavado com etanol 70. Finalmente o DNA
foi submetido a spin de quinze segundos em
centrífuga e encubado em estufa a 37ºC para
secagem. Em seguida, o DNA foi ressuspenso em
20µL de água MiliQ estéril e armazenado em
freezer a -20ºC. Para a verificação da
presença de DNA, as amostras (sem amplificação)
foram submetidas à eletroforese à 60 V, em
agarose gel 1,2, corados em solução de brometo
de etidio (1?/ml) para visualização em
transiluminador UV.
Resultados Os resultados obtidos na pesquisa
não contemplaram na sua totalidade os objetivos
propostos, o que, entretanto, não invalida os
dados obtidos e as soluções apontadas. Inicialmen
te, as larvas obtidas das Secretarias de Saúde
foram identificadas com o auxílio da chave de
identificação proposta por Oliveira Consoli
(1994), o que revelou a existência de espécies de
Aedes albopictus presentes entre os Ae.
aegypti. Durante o processo de extração do DNA,
o protocolo sugerido no projeto não se apresentou
eficiente, o que de imediato não revelou a
presença de material genético ao final do
processo de extração. Sendo assim, várias
modificações foram realizadas na tentativa de
estabelecer um protocolo de extração
eficiente. Finalmente, após manutenção do
transiluminador UV, troca de reagentes e novos
testes, obteve-se um extração com o protocolo
supracitado. No entanto, algumas das amostras não
apresentaram arraste de banda e sim brilho na
poli o que pode ser explicado pela ausência de
proteinase K no processo de extração.
Conclusões Os objetivos propostos no
projeto não foram alcançados. Entretanto, apesar
dos resultados obtidos diferirem dos esperados,
os mesmos apontam novos caminhos para a busca de
soluções e assim reafirmam o caráter permanente
de constante busca em pesquisa. Sendo assim,
novos estudos se fazem necessários para a o
estabelecimento de protocolos eficientes.
Bibliografia APOSTOL BL, BLACK WC 4th, REITER
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Genetic differentiation of Aedes aegypti
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47(6)893-901. WHO - World Health Organization.
Dengue prevention and control. Wkly Epidemiol
Rec. 2002 76 217-218. Apoio Financeiro CNPq /
Unisul
Fig.1 Preparação de alíquotas de DNA
Fig.2 Cuba de eletroforese