??PCR??

1
??PCR??
2
PCR????? ??PCR??????????? PCR?????
3
??

• ?????????,???PCR???????PCR?????,?PCR????????

4
PCR????

• NN02nN0(1E)n (E?1????)
• logNnlog(1E)logN0
• ??E???,logN????,n?????
  ?????logN0?,???????
• ?????????PCR???????,?????S??

5
PCR ??????

6
PCR ?????

• ???/???
• ???/???
• ???/???
• N ???????
• n ???????

log-phase analysis
end-point analysis
N
n
7
??PCR???PCR??
??????
??PCR ??PCR
??? ????? ??????
8
??PCR???PCR???
9
??PCR??

• ????
• ????
• ????
• ?????
• ?????
• ?????
• Taqman?
• Molecular beacon ?(?????)

10
??PCR ?????

• ????????????,????????????(?????DNA)
• ?????????????,????/???????,???????????????PCR?????
  ?

11
??PCR ?????
12
??PCR ?????

• ????
• ??
• ??
• ??
• ????

13
??PCR ?????

• ??
• ????,????
• ????????
• ??????????
• ??????????
• ??????????

14
??PCR ?????

• ??
• PCR?????????????????????
• ?????????,???????????????

15
?????????

• ??????????(????)????(????)??,??????????
• ???????????

16
??PCR ?????

• ??,??PCR?????(E)
• ??,??????????????

17
PCR???????

• PCR???????,?????????????????
• YnYn-1(1Ev) 0Ev1 (1)
• Ev??????
• Yn???n????PCR???????
• Yn-1?n-1????PCR???????

18
PCR???????

• ?????????,??????????????
• YnX(1Ee)n (2)
• Yn?PCR???????
• n????
• Ee???,??0?1??
• ??(2)?????????????(?????,???20?30)
• ??(2)????????PCR??????

19
??PCR????(E)???

• ???????E ???
• ??/??????
• ????????
• DNA???/??????
• ??????E ???(???????)
• ??????????
• ????????DNA???????????
• ??????????????Ev??

20
????(E)?????PCR???

• ?PCR????????,E ???,????PCR????????????????????????
  ?,????????????Yn?????E ?
• ??????????,?????
• YnYn-1(1Ev) ??E ?

21
????(E)?????PCR???

• ?????????,????????? YnX(1Ee)n?????
• E-1(Yi/Yi-j)1/j (3)
• j(?????????)??n
• Yj(??????????????)??Yn
• Yi-j(??????????????)??X

22
X(?????)???

• ?? E ???,????(4)?????????????????? X(?????)
• ??(4)?????YnX(1Ee)n?????
• XYn /(1E)n (4)

23
X ????????

• ??????,????(2)?????,?????Yn???????n????X?
• logYnlogXnlog(1E) (5)
• ?n0?,??????X?
• ??????(5)???????X?

24
(No Transcript)
25
????

• YnYn-1(1Ev) 0Ev1 (1)
• YnX(1Ee)n
  (2)
• E-1(Yi/Yi-j)1/j (3)
• XYn /(1E)n (4)
• logYnlogXnlog(1E) (5)

26
??????????

• ?????????????
• ??????????PCR????
• ????????????????????????????????????PCR??

27
????????
28
?????

• ??
• ???????
• ????
• ??

29
?????????

• ??????????????????????????????????
• ??????PCR??????????,?????????
• ??????????????(Gaussian)(??)?????,???????????,????
  ??????????
• ??????,????????

30
?????

• ??
• ?? ?????(????,????)????????
• ?? ????(biotin)???PCR??
• ?? PCR??(??????)?????????????
• ?? ??????????,????????????????????

31
?????

• ????(??TNF-a)
• 3' TCGGCGTAGCGGCAGAGGATGGTCT-CCCCCC-NH2-
  5'
• ????(??TNF-a)
• 3'- Biotin-TTGGGGCTCACTGTTCGGACATC GGGTA- 5'

32
?????
Avidin-HRP ????
NH2?????
Biotin?????
NOS??
33
?????
NOS group
capture probe
IL-6 amplicon
detection probe
avidin-HRP
TMB
34
?????

• ????
• ???????,????,?????PCR???????????,??????,?????,???
  ?????
• ??PCR?????????????????????????????????,??????????
  ??????????,??????????????????,?????????????

35
HBV DNA detection overview
36
AMPLICOR HCV TEST FORMAT
Wash, Add Avidin-HRP Conjugate
37
????PCR
???? ????
???? ???? ????
PCR ????
DNA?? ????
38
??PCR????
DNA
FQ-PCR
????
??????
????
??
RT-FQ PCR
RNA
??????
?????PCR??????
39
????PCR?????

• 2.????
• ???????
• ?????????
• ????
• 5 ???????(R)
• 3 ?????????(Q)
• Q ??? R ???????
• ??????,R ??????
• ???????
• ????
• ??3 ???????(R)
• ???5 ???????(Q)

1.?? 5 ? 3 ??????? ?????? PCR
? Taq?????DNA ??? ??(??DNA??),? ??? 5 ? 3
????? ??(????????? ????,??????? ???)
40
Taqman ??(1)

• PE????
• ??
• ??????PCR??????????????,? 5 ???????(Reporter,
  R), 3 ?????????(Quencher, Q), ????????,Q
  ?????R ???????,??,????????,R ?????????????

41
?????????
?????????????????, ????????????
42
????????

• ????(Qeporter),?????????
• ????(Quencher),??????????????,???????

43
Taqman ??(2)

• ??
• ?????PCR???,??????????????
• ?Taq??????, ???Taq???????,???5 ?R??,R??????
• ???????????????

44
Taqman ??(3)

• ??????????
• Taq? 5?3?????

45
Taqman ??(4)

• ?????
• ??
• ????????,????
• ?????????

46
5700
47
7700
48
7000
49
Molecular beacon ???(1)

• ??????
• ??
• ?????(R??)???????(Q??)??????????????????????????
• ???,??????R???Q??????, R????????Q????
• ????????????????

50
Molecular beacon ???(2)
51
?????????
52
Molecular beacon ???(3)

• ?????
• ??
• ?????
• ??
• ????????????,??????
• ?????????

53
LightCycler
54
Schematic of LightCycler
55
????PCR?????

• ????
• ?????,?????????
• ????,????????
• ????,??PCR???
• Taq?????? 5 ? 3 ???????
• ????,???????
• ??,???????????
• ??????

56
??PCR???????????

• ????????????????
• ?????????(?HCV)
• ????????(?HIV)
• ???????????
• ?????????
• ???????????????

57
??????HCV????
58
??????HBV????
59
??????HIV????
60
????IFN-a ?????HCV-1?????????????? N32
Lam et al - Hepatol 26 226, 1997
61
The Smartest Innovation in PCR
????? ???????? ??????? ????????? ????????????? ??
????
62
LightCycler ???
16
63
LightCycler Centrifuge Adapters
64
??????1
?? ?? ????
PCR?? ?? ???,????
PCR?? ?? ????,????0.3C
PCR?? ?? ??PCR??
PCR?? ?? ???????
PCR?? ???? ?????
65
??????2
?? ?? ????
???? ?? ????????0.02?,???5?
???? ?? ?????,????????,????
???? ?? ???????,?????,??????
???? ?? ???????
???? ???? ?????,??????
66
??????3
?? ?? ????
?? ?? ?????,??
?? ????? 10-20?l??
?? ?? ????
?? ??? ???????
?? ????? ????,?????
?? ?? ???,???,?????
?? ?? ??????,???????????????
67
LightCycler ????
Hydrolysis Probe Format
SYBR Green I
Hybridization Probe Format
Elongation Phase
Annealing Phase
Elongation Phase
68
LightCycler ??

69
??????????PCR??
Fluorescence -d (F1) / dT
Fluorescence (F1)
?? C
?? C

• Tumor Antigen
• GAPDH
• Mixed Templates

70
????????????
?????
????
??
? ? ?
71
Genotyping by Melting Peaks???? (Factor V)
72
LightCycler ?? FRET ??

• ?? 2 ???
• 1st probe pair with Fluorescein/LC Red 640
• 2nd probe pair with Fluorescein/LC Red 705
• ?? ????????????
• ?? ??PCR ??????????
  

73
CrosstalkEmission Spectra
Emission Filters
74
Crosstalk ????

• ??????
• - ???????
• ??????
• - A ccc-file is generated once per instrument
  and universally
• ??
• - LC?????????
• - ????????

75
?????????? TNF? ????
76
???????? ?? TNF? ????(1)
TNF LC Red 640 control LC Red 705
F2 with ccc

77
???????? ?? TNF? ????(2)
TNF LC Red 640 control LC Red 705
F3 with ccc

78
???????? ?? TNF? ????(3)
TNF LC Red 640 Control LC Red 705
F2 with ccc
79
LightCycler Intra-Assay ??? ?????? (PCR)
F2
F2/F1

• Baseline Adjustment None

F2 F2/F1 CV crossing
point 0.59 0.59
2nd Derivative CV crossing point 0.73
0.55 Fit Points
80
Summary of Product Features
??20 ?30 ????PCR ?????????20 µl ??????????? ??
????????,?????SYBR green I

• ????????????????????
• ??????????????
• ??????????????????????
• ????????PCR???????

81
The LightCycler Software Version 3????

82
LightCycler?????

• 1 ????30?????40???
• 2 ????????????????????,????????
• 3 ????????????????????
• 4 ?????101010??????????,???????
• 5 ?????????????CV??2,?????
• 6 ????????20?l, ???????????30?
  (????)?60?(????)
• 7 ????????PCR(????),????,??????,??PCR??
• 8 ???????????????????????????????
• 9 ???????20??,???45x30x40cm3
• 10 ???--??????????(??????,????,
• ????)?