Intrt du potentiel zta, de la taille et de la forme dans llaboration de micro et nanocapsules

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Intérêt du potentiel zêta, de la taille et de la
forme dans lélaboration de micro et nanocapsules

• Par Michel Terray
• Malvern Instruments
• Parc Club de lUniversité
• 30 rue Jean Rostand
• 91893 Orsay cedex
• Téléphone 01 69 35 18 08
• E-mail contact_at_malvern.co.uk
• Site web malvern.co.uk ou malverninstruments.fr

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Sommaire

• Définition du potentiel zêta
• Mesure de taille par diffraction et diffusion
  dynamique de la lumière
• Introduction à la masse moléculaire et au second
  coefficient de viriel
• Analyse de la forme

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Définition du potentiel zêta
Le potentiel zêta représente la charge que la
particule acquiert grâce aux ions qui lentourent
quand elle est en solution.
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Mécanismes affectant la stabilité

• Stabilisation Stérique Cela implique des
  polymères (ou tensio-actifs non ioniques ou
  protéines) ajoutés à la suspension et qui
  sadsorbent sur la surface de la particule pour
  causer la répulsion par encombrement de lespace
  interparticulaire.

• Le polymère peut être cher et dans lindustrie
  céramique doit être cuit en risquant de provoquer
  des zone de fragilité et de défauts

5
Mécanismes affectant la stabilité

• Electrostatique ou stabilisation par des charges
  Cet effet utilise de façon plus naturelle les
  interactions entre particules grâce à la
  distribution des espèces chargée (ions) dans la
  solution.

La stabilisation ou la flocculation du système
est contrôlée par la concentration en ions. Cest
un procédé réversible et bon marché. Le
potentiel zêta est un bon indicateur des
intéractions entre particules et donc de la
stabilité colloïdale.
6
Introduction à la théorie DLVO
Théorie développée par Derjaguin, Verwey, Landau
et Overbeek en 1940 qui suggère que la stabilité
des particules en suspension dépend dun
potentiel dinteraction total V T VA VR
VS VS est lenergie liée au solvant et souvent
négligeable VA -A / (12 p D2) force
attractive de Van der Waals VR 2 pe z2 a
exp(-kD) forces répulsives
7
Résultante des forces attractives et répulsives
Energie dinteraction totale
8
Nouveau concept de cellule de mesure

• Facile demploi
• Cellule jetable sans aucun entretien, ni
  nettoyage, ni alignement.
• Pas de contamination croisée
• Technologie brevetée
• Matériau Polycarbonate
• (potentiel zêta de paroi -75mv)
• Electrodes en cuivre recouvertes dor

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Evolution de la forme des capillaires

• Evolution du classique capillaire horizontal
  (cylindrique ou rectangulaire) vers le capillaire
  coudé et moulé dans un bloc de polycarbonate.
• Les électrodes sont en cuivre plaqué or.

10

• Mesure de la formulation des liposomes

VERSION 20-04-01
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Association volontaire déléments chargés et
dans une réaction de complexation
noyau
ADN
cytoplasme
PEI
éponge à protons
complexes cationiques
Endocytose
12
Le potentiel Zêta en thérapie génique

• La thérapie génique est le processus par lequel
  le matériel génétique est délivré au moyen de
  vecteurs à un patient pour des raisons
  thérapeutiques.
• Les vecteurs sont des véhicules - habituellement
  virus ou liposome micro ou nano capsules -
  utilisés pour transporter le matériel génétique
  pour cibler les cellules de lorganisme
• Les liposomes cationiques et anionique sont
  étudiés en tant que vecteurs pour la thérapie
  génique et leur efficacité de transfection est
  étudiées par de nombreuses équipes de recherche
  et des sociétés pharmaceutiques.

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Liposomes cationiques en thérapie génique

• Les liposomes cationiques (chargés positivement)
  sont complexés avec lADN qui lui, est sous forme
  de petits plasmides
• Le rapport liposomeADN est considéré comme
  essentiel pour une transfection optimale
• Les mesures de potentiel Zêta peuvent être
  utilisées pour optimiser le rapport entre les
  liposomes particuliers et différents plasmides.

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Structure des liposomes
Molécule lipophile
Molécule hydrophile
Phase aqueuse interne
Molécule amphiphile
15
Liposomes cationiques équilibrés par plasmides

Liposome cationique
Plasmides dADN
Complexes plasmides/liposomes
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Liposomes anioniques en thérapie génique

• Les liposomes anioniques sont utilisés pour
  encapsuler lADN
• LADN chargé négativement a besoin dêtre
  condensé en petites particules en ajoutant un
  agent tel que la polylysine (chargée
  positivement) avant lencapsulation
• Les mesures de potentiel Zêta peuvent être
  utilisées pour déterminer la quantité dagent de
  condensation nécessaire pour atteindre la
  neutralité afin davoir une plus grande
  efficacité dencapsulation

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Liposomes anioniques en thérapie génique
agent condenseur
plasmides condensés
Plasmides
Encapsulation dans des liposomes anioniques
Modification de surface avec du PEG
Liposome contenant des plasmides
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Liposomes anioniques neutralisés par Polylysine
4
0
2
0
0
Potentiel Zêta (mV)
10
10.4
10.8
11.2
11.6
12
12.4
Ratio de Mole dADN et de Polylysine
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Liposomes recouverts de PEG
Le plateau est caractérisé par un potentiel zêta
indépendant de la concentration en PEG . Le
plateau apparaît quand la surface du liposome est
saturée et quaucune molécule de PEG ne peut plus
y être adsorbée. Le plateau est atteint à une
concentration de 5 de mole de PEG.
STEALTH Liposome pour STérically Enhanced
Liposome THerapy
20

• Optimisation des réactions dencapsulation

21
Evolution du potentiel zêta d'une gomme arabique
en fonction du pH
22
Evolution du potentiel zêta d'une gélatine en
fonction du pH
Le point iso-électrique le point de charge
nulle dans ce cas sinon la définition est
différente
23
Choix de la meilleure gélatine
24
Favoriser lassociation et dans les réaction
dencapsulation (coacervation complexe)
Evolution du potentiel zêta d'une gomme et d'une
gélatine en fonction du pH
25
Etude de cas
A 0.0001 w/v B 0.001 w/v C 0.005 w/v D
0.01 w/v E 0.05 w/v F 0.1 w/v
G 0.5 w/v H 0.75 w/v I 1 w/v J 2
w/v K 10 w/v (neat sample)
26
Suivi de la concentration dune émulsion
parentérale
On passe par une valeur minimale de latténuateur
(position 5 pour concentration 0.05 en masse). Au
delà de cette valeur démarre des phénomènes
dabsorption de lumière diffusée par
léchantillon lui-même. Pour être sûr davoir
assez de signal latténuateur compense
labsorption.
27
Phase plot dune émulsion parentérale
Bon phase plot dune émulsion lipidique à 1
masse
28
Phase plot dune émulsion parentérale
Mauvais phase plot dune émulsion lipidique à
2 masse
29
Comparaison des Phase plot dune émulsion
parentérale
Superposition des phase plot dune émulsion
lipidique à 1 et 2 en masse
30
Diagramme en fréquence de lémulsion
La distribution de potentiel zêta est obtenue à
partir de la distribution en fréquence qui
résulte de la transformée de Fourier du signal
mesuré pendant la partie SFR (Slow Field
Reversal) de la mesure Ainsi la valeur moyenne du
potentiel zêta peut être mesurée jusquà 1 de
concentration massique. Les distributions de
potentiel zêta obtenues à cette concentration
sont très larges (largeur égale à 80mV) dûe à des
faibles rapports signal sur bruit de la lumière
détectée. La mesure à 0.5 est bien meilleure et
donne une largeur de pic de zeta égale à 10 mV.
31
Recouvrement de la paroi de la cellule par lipide
cationique
32
Recouvrement de la paroi de la cellule par lipide
cationique
33

• Etude de la taille par diffraction ou diffusion
  (DLS)

34
MASTERSIZER 2000
Étendues de mesure 0.02 à 2000 µm en voie
liquide 0.2 à 2000 µm en voie
sècheReproductibilité /- 0.5 Sources Laser
rouge He-Ne à 632 nm Diode bleue à
466nmPuissance du laser He-Ne 2 mW (laser
classe 1)Certification Latex certifiés NIST
35
Description dun granulomètre à diffraction laser
36
Diffraction de Mie
En 1905 Gustave Mie résout le problème de la
diffraction des ondes sur une sphère. Ce qui
permit dexpliquer la coloration des suspension
colloïdales dor en fonction de la taille des
particules. Dans la théorie de Mie la particule
est modélisée comme une sphère décrite par un
nombre complexe n A Bi A partie réelle
indice de réfractionB partie imaginaire
indice d'absorption
diffraction
absorption
diffusion
Rétro-diffusion
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Théorie de la diffraction de la lumière

• Langle de diffraction est inversement
  proportionnel à la taille.
• La quantité de lumière est proportionnelle à la
  taille
• Les grosses particules diffractent de fortes
  quantités de lumière sur des petits angles.
• Les petites particules diffractent de très
  faibles quantités de lumière mais qui sétalent
  de façon décroissante de 0 à des angles plus
  larges
• Le trait rouge marque la position
• du 1er minimum et non la fin du phénomène

Lumière diffractée par les particules
Source de lumière parallèle
Détecteur multi éléments à progression
logarithmique
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NanoS avec Optiques NIBS

• Le brevet NIBS (Non-Invasive Backscattering)
• Les optiques ne sont pas en contact avec
  léchantillon
• Rétrodiffusion langle de diffusion est de 173.
  Cest beaucoup plus en arrière que les
  goniomètres de diffusion

La zone de focalisation bouge automatiquement
pour permettre des mesures sur une large gamme de
concentration
39
Le phénomène Mouvement Brownien

• Mouvement aléatoire des particules dû aux chocs
  entre les molécules de solvant et les particules

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Fonction d'auto-corrélation
Pour une distribution monomodale G(t)
exp(-G. t ) exp (-D0q2t) t temps
d'échantillonnage G D0 q2 taux de
décroissance D0 coefficient de diffusion
translationnel q vecteur d'onde 4pn (sin
q) l 2
n indice de réfraction du milieu de
suspension l longueur donde de la source
laser q angle entre source laser et
photomultiplicateur q-1 quand la particule a
parcouru q-1 elle a perdu sa corrélation
(échelle dobservation )
41
Calcul du diamètre hydrodynamique
Loi de STOKES-EINSTEIN
k T
dH
3 p h D

• dH diamètre hydrodynamique (nm)
• T température absolue
• D coefficient de diffusion translationnel
• viscosité dynamique (cP) du milieu de
  dilution
• k constante de Boltzmann

42
Représentation du diamètre hydrodynamique
-













-



-


-

-
-

-

-










-





-

-


Le diamètre hydro-dynamique représente le
diamètre de la particule lépaisseur de la
double couche de solvatation qui lentoure.
43
Distributions en Intensité, Volume et Nombre
Mélange contenant un nombre égal de 5 et 50nm
particules sphériques
Nombre
44
Corrélogramme de particules de 1nm
45
Corrélogramme typique de grosses particules
46
Interprétation du corrélogramme

• Distribution Bimodale de micelles de DTaBr
  contaminées par des débris de membranes de
  cellulose
• En rouge avant filtration à 220nm
• En vert après filtration à 220nm
• DTaBr surfactant cationique ou bromure de
  dodécyltriméthylamonium

Avant filtration
Après filtration
47
Corrélogramme et mauvais fit
SUR DATBR 10-1M Mesure de qq chose de très petit
entre 0 et 10µs mais avec quelque chose de plus
gros entre 10 et 10000µs. On peut forcer le
calcul à ne passer que par les premiers points et
ignorer les défauts aux temps longs surtout sur
un échantillon aussi petit qui diffuse aussi peu.
La moindre impureté plus grosse va contribuer
énormément dans le signal en intensité bien
qu'elle soit insignifiante dans une
représentation en nombre.
48
Corrélogramme et bon fit
SUR DATBR 10-1M A la différence de lanalyse par
les Cumulants, NNLS et Contin ne loupent pas le
signal aux temps longs et vous donne une
distribution à 2 pics.
49
Analyse comparée entre NNLS et Contin sur micelles
La confirmation dun résultat avec un mode
danalyse (NNLS) par un autre mode (Contin) est
une preuve supplémentaire de la fiabilité dun
résultat
50
Particules coeur minéral /couronne polymérique
particules cristallines.
51
Poster Mme Zydowicz au congrès mondial des
émulsions
52
Effet des ultrasons sur la mini-émulsion de départ
53
Effet du volume de la phase aqueuse externe
54
Taille de la mini-émulsion de départ
Conditions optimales Volume dispersé/ Volume
continu 0.1 SDS 3 en poids Surfactant/
costabilisant 11 Durée des Ultrasons 15
minutes Puissance des ultrasons 90
55
Effet de la concentration en surfactant sur les
nanocapsules
On note un effet important du surfactant sur le
diamètre moyen des nanocapsules. La quantité de
SDS sera donc fixée à 10 pour obtenir une taille
minimale de 60 nm.
150,00
150,00
100,00
Droplets'
diameter(nm)
100,00
50,00
Droplets'
diameter(nm)
50,00
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,00
ratio of phases (Vdisp/Vcont)
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
ratio of phases (Vdisp/Vcont)
56
Effet des ultrasons sur les nanocapsules
On note un effet important des Ultrasons sur le
diamètre moyen des nanocapsules.
57
Image TEM de nanocapsules
Sonification duration
58
Stabilité des nanocapsules sur 2 mois
Reproductibilité de la mesure à t0
Stabilité au bout de 2 mois
Conditions optimales Volume dispersé/ Volume
continu 0.1 SDS 10 en poids Surfactant/
costabilisant 11 OH/CNO 5 Ultrasons 15
minutes à 90 Temps de réaction 6h à 40C
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• Analyse de la masse moléculaire et du
• 2nd coefficient de viriel

60
Mesure de la masse moléculaire Mw et du 2ème
Coefficient de Viriel
Pour les petites molécules telles que les
protéines, le tracé de KC/R en fonction de C la
concentration devrait être linéaire et
intercepter laxe des Y en un point qui
représente linverse de la masse moléculaire
(1/Mw). La pente est proportionnelle au second
coefficient de viriel. Ce type de graphe
sapparente au tracé de Zimm en plus simple et
sappelle un tracé de Debye. Dans les tracés de
Debye , il ny a pas de variation de langle de
mesure mais juste une variation de la
concentration en solide de léchantillon
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2eme coefficient de Viriel (A2)

• A2 est déterminé à partir de la pente dun tracé
  de Debye.

Equation pour tracé de Debye
62
Masse moléculaire déterminée par tracé de Debye

• Contrairement à lopinion généralement répandue,
  la mesure de la masse moléculaire peut être
  effectuée à un seul angle.

63
Conclusion sur la masse moléculaire

• Quand on remplit des capsules ou autres
  nanoparticules et que la taille ou le potentiel
  zêta ne change pas, on peut étudier lévolution
  de la masse moléculaire pour sonder ce qui a
  changé dans la structure ou à lintérieur de la
  particule.

64
Conclusion sur la taille

• Cest la variation de diamètre hydrodynamique qui
  nous renseigne sur ladsorption déléments sur la
  surface de la particule que lon tente de
  modifier, pour en améliorer le comportement.

65

• Analyse de la forme, de la couleur des
  nanocapsules

66
Présentation du FPIA 3000

• Permet la mesure de suspensions et émulsions dans
  leau, les alcools
• et les glycols (en option dans les aromatiques)
• Etendue de mesure 0.5 à 300 µm
• Durée de la mesure (rinçage compris 150
  secondes)
• Mesure jusquà 360 000 particules (toutes les
  images sont sauvegardées)
• 26 paramètres morphologiques et granulométriques

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Cellule de mesure à contrainte hydrodynamique
Les particules sont orientées par le flux et
présentent leur plus grande surface face à la
caméra.
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Exemple de résultat obtenu
Identification
Distribution granulométrique (Nb ou Vol)
Distribution de formes
Calcul diamètre circularité
Courbe de fréquence de la distribution de formes
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Présentation du Morphologi G2
Microscope Préparateur à platine
motorisée déchantillons
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Unité de dispersion de poudres sèches

• Principe
• La pression dair exercée sur léchantillon
  accélère les particules le long de lentonnoir
• Un flux turbulent avec des forces de cisaillement
  élevées suite à limpact sur la bille dacier
  désagglomère les particules et les disperse
  uniformément sur la plaque en verre.

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Analyse de micro-capsules
Détermination des taux respectifs dagglomérats
de capsules et de grosses capsules (coalescence)
grâce au diagramme de circularité
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Analyse de micro-capsules
Aide à la formulation et au développement des
méthodes danalyse par granulométrie laser. On
distingue clairement la double population en
fonction dun critère basé sur la circularité
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Aide au développement dune méthode
Sans ultrasons
Avec ultrasons
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Détection de faibles proportions dagglomérats
Reproductibilité (3 opérateurs 6 jours)
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Détection de faibles proportions dagglomérats
Evolution agglomérats en fonction des ultrasons
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Homogénéité des particules
s dintensité 65
s dintensité 22
Possibilité de quantifier lhomogénéité de la
lumière qui traverse la particule
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Dispersion dune suspension
Aide au développement de méthodes danalyse par
granulométrie laser. Autre exemple principe
actif dans du cyclohexane avec ultrasons
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Dispersion dune suspension
Particules dispersées grâce à un tensio actif