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1
Le Modèle Initial dActivation de la Transcription
Deux Elements de Contrôle Enhancer et Promoteur
Proxymal 1. Fixation de l Activateur sur
l Enhancer 2. Aide au Recrutement du PIC 3.
Chargement du Complexe dInitiation
Mise en place dun Modèle Transcriptionel
Universel LAccessibilité nest pas un
Problème Puisque lADN nest pas Reconstitué En
Chromatine
TIBS, 2005 30(11)593. Tora L. The role of
enhancers as centers for general transcription
factor recruitment
2
Deux Familles de Coactivateurs
1.
2.

• Les Co-Facteurs qui Modifient la Structure de la
  Chromatine
• Les Co-Facteurs qui Favorisent le Recrutement de
  lARN Polymérase

3
La Notion dEnhanceosome

Pol
TF
Première Hypothèse Un Facteur de Transcription
Permet lAssemblage du Complexe dInitiation
-

Pol
TF4
TF3
TF2
TF1
TF8
TF7
TF6
TF5
Activateurs
Répresseurs
Hypothèse Actuelle Plusieurs Facteurs de
Transcription sAssemblent Pour Former un
Enhanceosome.
4
Le Code des Histones
Les Histones Portent des Modifications Sur leur
Partie N-Terminale (Acétylation, Méthylation,
Sumoylation)
Ces Marques Coderaient pour lActivation Ou la
Répression des Gènes
Marques Activatrices
Marques Répressives
5
Ce quApporte le Modèle Procaryote
4. 106 Bases 1000 Promoteurs
s A
s B
s C
s ...
L Utilisation de Différentes Formes de Protéines
Sigma Permet L Activation de Gènes Différents
ARN Polymérase
sB
Promoteur A
Promoteur B
6
Ce quApporte le Modèle Procaryote
Holoenzyme
Transcription Possible
Promoteur
Transcription Impossible
Transcription Impossible
7
Ce quApporte le Modèle Procaryote
Signalisation
Glucose
Récepteurs
AMPc
Régulation Transcription (Liaison ADN)
Régulation Transcription
CAPPolymérase
8
Ce quApporte le Modèle Procaryote
La Fixation du Complexe dInitiation de la
Transcription Doit Etre Stabilisée
Toute Protéine Capable dAccélérer ou de Ralentir
lAssemblage du Complexe Transcriptionel Active
ou Réprime la Transcription
9
Le Complexe dInitiation de la Transcription
Il est Composé de Trois Entités . La
Polymérase, Constituée de 12 Sous-Unités . 5
Facteurs Généraux, TFIIB, D, E, F, H . Le
complexe Mediator, 20 sous-unités En tout cela
fait plus de 60 Sous-Unités, plus de 3 millions
de Daltons! Les Deux Premiers sont Communs aux
Procaryotes, Mediator est Propre aux Eucaryotes
Asturias FJ. 2004. Curr Opin Struct Biol.
14(2)121-9.
10
Le CTD ou C-Terminal Domain
1 Sortie de l ARN
Zone Flexible du CTD Qui Permet son Mouvement
et Les contacts
Hampsey et al. Cell 2002 108(4) 453-463 Cramer
et al. Science 2001, 2921863
11
Le Domaine CTD de l ARN Polymérase
CTD C Terminal Domain
. Répétition Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser 26 fois
chez la levure et 52 fois chez l homme . CTD
est très conservée dans les espèces mais absent
chez ARN Pol I et ARN Pol III
12
Fonctionnement de lARN Polymérase
Hela
Chromatographie Clonage
Extrait Cellulaire
ARN Polymérase (Purification ?)
Promoteur
Introns-Exons
Site dInitiation de la Transcription
ARN Primaires Correctement Initiés ?
LARN Polymérase Seule ninitie pas Correctement
la Transcription Elle ne Reconnaît pas le Site
dInitiation
Tora L. TIBS, 2005 30(11)593 The role of
enhancers as centers for general transcription
factor recruitment
13
L ARN Polymérase de type II Principes de
Fonctionnement
Facteurs Généraux De la Transcription
Pas de Transcription
Transcription
La Synthèse d ARN ne se Fait quen Présence de
Facteurs Supplémentaires Appelés Facteurs
Généraux de la Transcription
14
Assemblage des Facteurs Généraux de la
Transcription
15
L ARN Polymérase de type II Principes de
Fonctionnement
TATA
PIC
Facteur
de Transcription
Le Facteur de Transcription Stabilise le
Complexe dInitiation de la Transcription
Des Facteurs de Transcription Régulent
l Expression des Gènes en Facilitant Ou En
Bloquant l Activité des Facteurs Générauxc
16
La Transcription, Rappels et Compléments
I. Les Etapes de la Transcription Construction
d un Modèle Transcriptionnel in vitro Les
Médiateurs de la Transcription Le Code des
Histones Les Apports du Modèle Procaryote
(Spécificité et Coopérativité) II. Le Complexe
d Initiation de la Transcription Structure de
lARN Polymérase, Domaine CTD et Elongation Les
Facteurs Généraux de la Transcription La
Protéine TBP et Les TAFs Reconnaissance des
Promoteurs, Spécificité de la Réponse
Transcriptionnelle Chargement du Complexe
d Initiation, Exemple du Récepteur aux
Androgènes III. Les Autres Complexes
Impliqués TFIIB et Orientation de la
Transcription TFIIH, Réparation de l ADN,
Elongation et Cycle Cellulaire
17
Assemblage des Facteurs Généraux de la
Transcription
18
Le Complexe TFIID
Immunoprécipitation TFIID
TBP (38 kD)
TFIID Est le Premier Facteur Général À Contacter
l ADN
Wolfe AP, Trends in Biochemical Science 2001,
26665
19
Importance du Facteur TBP
TBP
. TBP est une des Protéines les Plus
Conservées De lEvolution . TBP régule
linitiation Faite par les Polymérases De Type I,
II et III . TBP a une Structure en Forme de
Selle de Cheval . TBP Induit une Forte Torsion
de lADN
TATA
20
Caractéristiques de TBP
Quelque Soit la Polymérase, TBP est Décrite à
lOrigine comme la Sous-Unité du Complexe
dInitiation qui Assure le Premier Contact Avec
l ADN
21
TBP Induit une Torsion de l ADN
TBP Induit des Torsions de l ADN Cette
configuration Faciliterait le Recrutement des
Autres Facteurs Généraux
TBP
TATA Box
ADN
Torsion de l ADN
22
Contrôle de la Transcription L Opéron Lactose
La Protéine CAP Induit Une Torsion de lADN qui
Stabilise l ARN Polymérase
23
TFIID/TBP Active la Transcription de Base
Transcription de Base
Réaction de Transcription In Vitro
-

-

NFTI
NFTI
TBP/TFIID Cellulaires polymérase Avec ou Sans
NFTI
TBP/TFIID clonés polymérase Avec ou Sans NFTI
Cell 1990, 611187
24
Méthodes de Détection

• Les Expériences de Protection
• 1. Mélande dune sonde ADN complémentaire
• 2. Hybridation
• 3. Digestion de l ADN Simple Brin à l
  EndoNucléase S1
• 4. Dénaturation et Migration sur gel dacrylamide

25
Méthodes de Détection

• Primer Extension
• 1. Préparation dune Amorce Marquée (20 nt)
• 2. Hybridation
• 3. Extension par une Reverse Transcriptase
• 4. Dénaturation et Migration sur gel dacrylamide

26
TFIID/TBP Active la Transcription de Base
Cell 1990, 611187
27
TFIID/TBP Active la Transcription de Base
Cloné
Extrait Cellulaire
Le Complexe TFIID/TBP ne Permet pas la Régulation
de la Transcription
28
Les co-Activateurs Associés à TBP les TAF
Immunoprécipitation TFIID
TBP
6 autres Peptides co-purifient avec La
Précipitation de TFIID
Découverte des TAFs ou TBP Associated Factors
. Au moins 8-12, de PM compris entre 18 et 250
kDa.
Wolfe AP, Trends in Biochemical Science 2001,
26665
29
Rôle des TAF dans lActivation Transcriptionnelle
Réaction de Transcription In Vitro en Présence
des Composants
Cell 1991, 66563
30
Rôle des TAFs dans lActivation
Transcriptionnelle
Cloné
TFIID TBPTAFs
Le Complexe TFIID est Constitué de TBP et des
co-Activateurs TAFs Les TAFs Confèrent la
Capacité dActiver la Transcription
Wolfe AP, Trends in Biochemical Science 2001,
26665
31
(No Transcript)
32
TAFs et Spécificité
Immunoprécipitation TFIID
TBP
6 autres Peptides co-purifient avec La
Précipitation de TFIID
. Au moins 8-12, de PM compris entre 18 et 250
kDa.
Wolfe AP, Trends in Biochemical Science 2001,
26665
33
Spécificité des co-Activateurs TAF
NFTI Contacte TAF150
SP1 Contacte TAF110
Cell 1994, 7993
34
Spécificité des co-Activateurs TAF
Les Différents TAFs Permettent le Contact avec le
PIC Chaque Facteur de Transcription Contacte
un(des) TAFs Spécifiques
35
L Activation Transcriptionnelle Dépend De la
Formation d un Enhanceosome
1. La Mise en Place Coordonnée de ce Complexe
Permet lActivation de la Transcription
Formation d un Enhanceosome
La Transcription Repose sur l Intégration de
Plusieurs Signaux
SP1
Etc...
TAF 110 Contact
NFT1
TAF 150 Contact
TAF 250 Rôle Architectural
36
La Transcription, Rappels et Compléments
I. Les Etapes de la Transcription Construction
d un Modèle Transcriptionnel in vitro Les
Médiateurs de la Transcription Le Code des
Histones Les Apports du Modèle Procaryote
(Spécificité et Coopérativité) II. Le Complexe
d Initiation de la Transcription Structure de
lARN Polymérase, Domaine CTD et Elongation Les
Facteurs Généraux de la Transcription La
Protéine TBP et Les TAFs Reconnaissance des
Promoteurs, Spécificité de la Réponse
Transcriptionnelle Chargement du Complexe
d Initiation, Exemple du Récepteur aux
Androgènes III. Les Autres Complexes
Impliqués TFIIB et Orientation de la
Transcription TFIIH, Réparation de l ADN,
Elongation et Cycle Cellulaire
37
Spécificité dActivation de la Transcription
?
?
?
?
?
?
?
?
Gène 1
Etc..
Gène 2
Etc..
Les Gènes sont Inaccessibles
Comment se Fait le Choix ?
38
Les Apports du Modèle Procaryote
4. 106 Bases 1000 Promoteurs
s A
s B
s C
s ...
L Utilisation de Différentes Formes de Protéines
Sigma Permet L Activation de Gènes
Différents Rôle des Facteurs de Transcription
39
Reconnaissance du Promoteur
Pour un Promoteur Eucaryote, Trois zones sont
Essentielles TATA à -30 Initiateur à 1 DPE à
30
. Il existe des Promoteurs qui ne Possèdent pas
cet Arrangement . TATA et Inr Peuvent Coopérer ou
Etre Séparés
40
Reconnaissance du Promoteur
41
Reconnaissance du Promoteur
Différents Complexes Formés
. TBP Reconnaît la TATA Box . TAF150/250 Fixent
Inr . TAF40/60 Fixent DPE
Différents Promoteurs Ciblés
Wolfe AP, Trends in Biochemical Science 2001,
26665
42
Spécificité des co-Activateurs TAF
Chaque TAFs est Spécifique dun Gène Cible et
Dicte la Spécificité DExpression ? NFT1 et SP1
Activent des Gènes Différents car Ils Contactent
des TAFs Différents Qui les Ciblent vers des
Zones Différentes
INR ?
43
Les Protéines TBP
Il Existe Plusieurs Isoformes de TBP TBP, TBP2
et TLF chez lhomme Définies par un Pourcentage
d Homologies en Acides Aminés. Toutes Gardent
la Même Structure
Toral et al. The EMBO Journal (2004) 23 (1) 28
44
Les Différents Complexes TFIID
Avec TBP
Sans TBP
. Certains Complexes TFIID Ne contiennent pas
TBP . Certains TAFs sont Spécifiques Dun Type
Cellulaire Taf4b Lymphocytes B Taf7L
Spermatozoïdes
Tora et al. The EMBO Journal (2004) 23 (1), 28
45
Spécificité dActivation de la Transcription
Différents Facteurs de Transcription
Différents Isoformes de TBP
Différents Isoformes de TAFs
Choix de Formation dun Complexe dInitiation
Spécifique dun Gène
?
?
?
?
?
?
?
?
Programme Génique Lymphocyte B
Programme Génique Muscle
Gène 1
Etc..
Gène 2
Etc..
46
Spécificité dActivation de la Transcription

Pol
TF
Signalisation
Association Avec TAFs 40/60
Association Avec TBP
Association Avec TAFs 150/250
TATA
Inr
DPE
Gène 1
Gène 2
Gène 3
Les TAFs Permettraient la Sélection des
Promoteurs et Assureraient La Diversité de la
Réponse Transcriptionnelle
47
Spécificité des co-Activateurs TAF
Les Différents TAFs Permettent le Contact avec le
PIC Chaque Facteur de Transcription Contacte
un(des) TAFs Spécifiques
48
La Transcription, Rappels et Compléments
I. Les Etapes de la Transcription Construction
d un Modèle Transcriptionnel in vitro Les
Médiateurs de la Transcription Le Code des
Histones Les Apports du Modèle Procaryote
(Spécificité et Coopérativité) II. Le Complexe
d Initiation de la Transcription Structure de
lARN Polymérase, Domaine CTD et Elongation Les
Facteurs Généraux de la Transcription La
Protéine TBP et Les TAFs Reconnaissance des
Promoteurs, Spécificité de la Réponse
Transcriptionnelle Chargement du Complexe
d Initiation, Exemple du Récepteur aux
Androgènes III. Les Autres Complexes
Impliqués TFIIB et Orientation de la
Transcription TFIIH, Réparation de l ADN,
Elongation et Cycle Cellulaire
49
Le Chargement du Complexe dInitiation Plusieurs
Théories
Formation du PIC puis Fixation Promoteur
Assemblage Séquentiel Sur le Promoteur
50
Le Chargement du Complexe dInitiation Plusieurs
Théories
Contact
Pol
TF
Un (les) Facteur de Transcription Permet
lAssemblage du Complexe dInitiation
Quel Rôle Pour les Activateurs et Répresseurs ?
Formation ?
Contact ?
TF
Est-ce que le PIC est Préformé ?
51
3eme Hypothèse . Le PIC se Fixe sur les
Enhancers et est Preformé avant Activation . La
Modification de la Structure de la Chromatine
Permet de faire Basculer le Complexe
dInitiation sur le Promoteur Proxymal .
Mécanisme ?
Torsion De lADN
Tora L. TIBS, 2005 30(11)593 The role of
enhancers as centers for general transcription
factor recruitment
52
Le Chargement du Complexe dInitiation Exemple du
Récepteur aux Androgènes

• Les Récepteurs Intracellulaires

Molécule de signalisation hydrophobe Androgènes
Protéines de transport
Récepteur intracellulaire Récepteur aux
Androgènes (AR)
Activation des Gènes de Réponse aux Androgènes
Par AR
Myles Brown, Molecular Cell 2002 (9) 601-610
53
(No Transcript)
54
Le Chargement du Complexe dInitiation Exemple du
Récepteur aux Androgènes
Enhancer
Promoteur
Enhancer
Promoteur
Observation
TF
TF
Promoteur
Enhancer
LActivateur (Récepteur Androgène) Est Détecté à
la Fois sur lEnhancer et le Promoteur
Myles Brown, Molecular Cell 2002 (9) 601-610
55
Le Chargement du Complexe dInitiation Exemple du
Récepteur aux Androgènes
Anti-Pol II
Promoteur (I)
Zone (II) Intermédiaire
Anti-Pol II
Enhancer (III)
Anti-Pol II
Pol
Pol
Promoteur
Enhancer
II
La Polymérase Est Détectée à la Fois sur
lEnhancer et le Promoteur
Myles Brown, Molecular Cell 2002 (9) 601-610
56
3eme Hypothèse . Le PIC se Fixe sur les
Enhancers et est Preformé avant Activation . La
Modification de la Structure de la Chromatine
Permet de faire Basculer le Complexe
dInitiation sur le Promoteur Proxymal .
Mécanisme ?
Torsion De lADN
Tora L. TIBS, 2005 30(11)593 The role of
enhancers as centers for general transcription
factor recruitment
57
Le Chargement du Complexe dInitiation Exemple du
Récepteur aux Androgènes
Formation dun Enhanceosome (Complexe
Protéique) Qui Contacte lADN en Plusieurs
Points Mouvements et Torsion de lADN
Myles Brown, Molecular Cell 2002 (9) 601-610
58
La Transcription, Rappels et Compléments
I. Les Etapes de la Transcription Construction
d un Modèle Transcriptionnel in vitro Les
Médiateurs de la Transcription Le Code des
Histones Les Apports du Modèle Procaryote
(Spécificité et Coopérativité) II. Le Complexe
d Initiation de la Transcription Structure de
lARN Polymérase, Domaine CTD et Elongation Les
Facteurs Généraux de la Transcription La
Protéine TBP et Les TAFs Reconnaissance des
Promoteurs, Spécificité de la Réponse
Transcriptionnelle Chargement du Complexe
d Initiation, Exemple du Récepteur aux
Androgènes III. Les Autres Complexes
Impliqués TFIIB et Orientation de la
Transcription TFIIH, Réparation de l ADN,
Elongation et Cycle Cellulaire
59
Caractéristiques de TFII B
TFIIB Interagit avec lElément BRE du Promoteur
et TFIID
Important pour la Reconnaissance du Site
d Initiation de la Transcription
60
Rôle de TFIIB dans lInitiation
Complexe dInitiation TFIIB
Complexe dInitiation TFIIB Mutés
Introns-Exons
Introns-Exons
Promoteur
Site dInitiation de la Transcription
Promoteur
Distance ? (40-120 bp chez la levure)
Initiation Décalée
TFIIB (et lARN Polymérase) Déterminent La
Position du Site dInitiation de la Transcription
Kadonaga JT Ann. Rev. Biochem. 2003, 72449-79
61
Caractéristiques de TFIIF
Le Rôle Majeur de TFIIF Est dEscorter l ARN
Polymérase
TFIIF
ARN Pol
62
Caractéristiques de TFIIH
9 sous unités 500 kDa
TFIIH Comprend Plusieurs Sous Unités Ayant des
Fonctions Différentes . Deux Hélicases XPB et
XPD . Ouverture de l ADN . Réparation de
l ADN . Le complexe cdk7, cyclin H et MAT1 .
Cycle Cellulaire CAK . Libération du Promoteur
63
(No Transcript)
64
Structure de LARN Polymérase de type II
Le brin codant est en bleu, non codant en vert.
LARN est en rouge. Les structures protéiques
sont en gris et orange, correspondant à une
structure modile, la pince (clamp)
Dénaturation de lADN Hybridation ADN-ARN sur 9
paires de Base
Pince (clamp) Mobile
Asturias FJ. 2004. Curr Opin Struct Biol.
14(2)121-9.
Kornberg DR Febs Letter. 579 (4) 899-9.
Structural basis of eukaryotic gene transcription
65
Caractéristiques de TFIIH
Gràce aux Hélicases XPB et XPD ,TFIIH est
Responsable de la Formation Du Complexe Ouvert
Cell 1995, 8021
66
TFIIH Est Impliqué Dans la Réparation de l ADN
9 sous unités 500 kDa
TFIIH Comprend Plusieurs Sous Unités Ayant des
Fonctions Différentes . cdk7, cyclin H et MAT1,
Cycle Cellulaire, Libération du Promoteur . Deux
Hélicases XPB et XPD, Ouverture de l ADN . XPB
et XPD Jouent un Rôle Important dans les
Processus de Réparation de l ADN
67
TFIIH Est Impliqué Dans la Réparation de l ADN
1. Détection de la Lésion Recrutement de TFIIH
Lésion sur l ADN
2. Ouverture et Dénaturation De l ADN par XPD et
XPB
3. Réparation de la Lésion Par les Enzymes de
Correction
Curr Opin Genet Dev. 1996 Feb6(1)26-33
68
Importance Clinique de TFIIH/XPD
La Trichothiodystrophie (TTD) Le Syndrôme
Xeroderma Pigmentosum (XP) et Le Syndrôme de
Cockayne (CS) Sont des Maladies Génetiques
Associées à . Retard Mental . Sensibilité très
Forte aux UV Cancer de la Peau . Développement
Anormal
Toutes ces Maladies sont Caractérisées par des
Défauts de Réparation de l ADN
Quel est le Gène Responsable (Correction) ?
Trends Genet 2001 May17(5)279-86
69
Importance Clinique de TFIIH/XPD
XPD ne fonctionne plus dans les Systèmes de
Réparation de l ADN
Absence de Réparation de l ADN Blocage de la
Transcription
Développement Anormal
70
Importance Clinique de TFIIH La Protéine p53
71
(No Transcript)
72
TFIIH Est Impliqué Dans la Réparation de l ADN
et dans l Activation de p53
Le Complexe TFIIH Contient p53
1. Détection d Anomalies sur l ADN
XPD
p53
2. Activation de p53 Arrêt du Cycle Cellulaire
Nature Genetics 1995 Jun10(2)188-95
73
Caractéristiques de TFIIH
9 sous unités 500 kDa
TFIIH Comprend Plusieurs Sous Unités Ayant des
Fonctions Différentes . Deux Hélicases XPB et
XPD . Ouverture de l ADN . Réparation de
l ADN . Le complexe cdk7, cyclin H et MAT1 .
Cycle Cellulaire CAK . Libération du Promoteur
74
Régulation des Complexes Cycline/cdk
75
Le Complexe CAK Fait Partie de TFIIH
Cycline H
TFIIH Contient le Complexe CAK, Régulateur du
Cycle Cellulaire
cdk7
MAT1
cdk7
CAK est Composé de Trois Sous-Unités
CAK
MAT1
Cycline H
Quel est le Rôle de CAK dans la Transcription
? Quel est le Rôle de TFIIH dans le Cycle
Cellulaire ?
76
La Phosphorylation de l ARN Polymérase
Mise en Place du Complexe d Initiation L ARN
Polymérase de type II est Hypophosphorylée
Début de l Elongation La Polymérase
est Hyperphosphorylée
La Polymérase entre dans le complexe
d initiation sous une forme Non phosphorylée et
démarre l élongation sous une forme phosphorylée
La Phosphorylation est Responsable du Démarrage
de l Elongation
77
Le Domaine CTD de l ARN Polymérase
CTD C Terminal Domain
. Répétition Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser 26 fois
chez la levure et 52 fois chez l homme CTD est
le substrat d un très grand nombre de
kinases Cdk, MAP Kinases, DNA-PK, etc
78
(No Transcript)
79
La Kinase Correspond au Complexe Cycline
H/MAT1/cdk7
80
CTD, TFIIH, cdk7 et Cycle Cellulaire
81
Importance du Facteur TFIIH
Contrôle de lElongation
Contrôle De la Réparation De l ADN
Contrôle du Cycle Cellulaire
TFIIH
Formation du Complexe Ouvert