Diapositiva 1

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Tema 11. Introducción de mutaciones en el
cromosoma
Transformación con DNA lineal Uso del fago l como
vector de transferencia Uso de sistemas
especiales Uso de plásmidos especiales Verificaci
ón del intercambio por Southern blot marcaje
de la sonda corte del DNA cromosómico transf
erencia a membrana hibridación con la
sonda Revelado
2
Intercambio
cromosoma E. coli
gen mutado en el plásmido
cromosoma E. coli
gen mutado en el cromosoma mutante de E. coli
3
Intercambio
cromosoma E. coli
gen mutado en el plásmido
cromosoma E. coli
gen mutado en el cromosoma mutante de E.
coli gen silvestre
asi NO podemos analizar las consecuencias de la
mutación
4
Intercambio
cromosoma E. coli
gen mutado en el plásmido
cromosoma E. coli
gen mutado en el cromosoma mutante de E. coli
necesitamos recombinación a ambos lados del gen
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Método 1 Transformación con DNA lineal
E. coli recBC sbcB
recBC- inactivan la actividad helicasa-exonucleasa
de DNA de doble cadena frente a un fragmento de
DNA lineal PERO estas actividades son necesarias
para la recombinación sbcB- inactiva la Exo I lo
que permite la persistencia de moléculas que
puede usar RecF en recombinación
3
6
Método 2 Uso del fago l como vector de
transferencia
gen silvestre
gen mutado en el plásmido
gen mutado
Cam
fago l recombinante
Km
fago l modificado

cromosoma E. coli
Km
cromosoma E. coli con el gen mutante
y sin la copia del gen silvestre
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Método 3
cromosoma E. coli oriC D1071 oriR1
minicromosomas con la secuencia oriC modificada
Uso de sistemas especiales
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Método 4 Uso de plásmidos especiales pMAK700
plásmido con gen mutado
cam
cromosoma con gen silvestre
1ª recombinación
30ºC cam
2ª recombinación
cromosoma
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Método 3 Uso de plásmidos especiales pMAK700
Incubamos las colonias individualmente a 44ºC -
cam
perderán TODAS el plásmido y la resistencia a
cloranfenicol?
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Método 3 Uso de plásmidos especiales pMAK700
Incubamos las colonias individualmente a 44ºC -
cam
perderán TODAS el plásmido y la resistencia a
cloranfenicol?
mutante
SI
verificar por Southern blot que copia del gen
está presente en el cromosoma EL GEN NO ES
SENCIAL
silvestre
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Método 3 Uso de plásmidos especiales pMAK700
Incubamos las colonias individualmente a 44ºC -
cam
perderán TODAS el plásmido y la resistencia a
cloranfenicol?
mutante
NO
gen esencial? si el plásmido que lleva la copia
del gen silvestre no puede perderse en las
bacterias que llevan el gen mutante en el
cromosoma EL GEN ES ESENCIAL (las bacterias
serían inviables)
silvestre
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Verificación por Southern blot
1. Aislar y cortar DNA con ER 2. Separar los
fragmentos en una electroforesis 3-4.Transferi
r los fragmentos a una membrana
5.Hibridar los fragmentos con una sonda
marcada 6.Detectar los fragmentos por el marcaje
de la sonda
ER
silvestre
mutante
genotipos
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DNA cromosómico enzima de restrictión
gel de agarosa
desnaturalizar DNA (NaOH)
Hibridar DNA con la sonda marcada
membrana
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Marcaje de la sonda
métodos PCR Random primer
Traslación del corte
cebadores aleatorios
100ºC
DNAasaI Mg
Klenow (no exo 5) dNTP-a32P
DNApolimerasa I (exo 5) dNTP-a32P
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Marcaje de la sonda
métodos
marcaje de 5-P con g32P-ATP
Polinucleótido kinasa
g32P-ATP
g32P
marcaje de 3-OH con dATP-a32P
Transferasa terminal
3
3
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Marcaje de la sonda
impresión placa fotográfica
Detección

• Radiactividad 32P, 33P, 35S

marcamos la sonda usando un nucleótido (dNTP)
radiactivo en el método elegido
b) Quimioluminiscencia producción de luz
mediante una reacción química
marcamos la sonda usando un nucleótido (dNTP)
modificado con una molécula (digoxigenina, DIG)
usando el método elegido
luz
impresión placa fotográfica
sustrato (CSDP, PPD, Luminol...)
anti- DIG con fosfatasa alcalina
peroxidasa
sonda marcada con DIG
DNA-mb
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Verificación de mutaciones por Southern blot
elección de las sondas (1) marcaje de la sonda
(2) aislamiento del DNA cromosómico (muestra
chDNA) (3) corte con enzimas de restricción
(4) Southern (5) electroforesis/desnaturalizació
n/transferencia a membrana/ hibridación con
la sonda análisis de las bandas (6)
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cortamos con las enzimas PstI y EcoRI
AQ9544
AQ9543
AQ664
AQ634
C
C
A
B1
B1
B
C
B2
B2
D