ANБLISES FENOTНPICAS E GENOTНPICAS UTILIZADAS NO CONTROLE DE QUALIDADE

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Conformidade de Material Biológico ITAL
maio/2005
ANÁLISES FENOTÍPICAS E GENOTÍPICAS UTILIZADAS NO
CONTROLE DE QUALIDADE
Lidiane Botelho lidiane_at_ital.org.br
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• ALIMENTOS FUNCIONAIS
• CONTROLE DAS ESPÉCIES PRESENTES
• MÉTODOS DIFERENCIAIS DE QUANTIFICAÇÃO E
  QUALIFICAÇÃO
• AUMENTO DE PRODUTOS NO MERCADO BRASILEIRO
• MUDANÇAS DA NOMENCLATURA OFICIAL

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Outros aspectos -Industria de Alimentos
Funcionais -Informações tem que ser documentadas
e disponíveis -Monitorar o nº de células e a
sua quantificação nestes alimentos é de extrema
importância - No entanto vários estudos vem
comprovando o contrário, principalmente pela
falta de padronização dos métodos.
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DIAGNÓTICO BACTERIOLÓGICO

• DEMONSTRAÇÃO DIRETA DA BACTÉRIA
• EXAME AO MICROSCÓPIO
• COLORAÇÃO DE GRAM
• COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
• -DEMONSTRAÇÃO DE ANTÍGENOS (MÉTODOS
  IMUNOLÓGICOS- ELISA)
• -DEMONSTRAÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS
  (CROMATOGRAFIA)
• -DEMONSTRAÇÃO DE DNA BACTERIANO

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• TAXONOMIA BACTERIANA
• -CARACTERIZAÇÃO E DESIGNAÇÃO DOS MICRORGANISMOS
• -E ORGANIZAÇÃO DOS MO. EM GRUPOS
• DIVIDIDO EM
• NOMENCLATURA (espécie, gênero ou família)
• CLASSIFICAÇÃO (agrupamento das bactérias em Taxa)
• IDENTIFICAÇÃO
• TAXONOMIA POLIFÁSICA
• - NÃO É MAIS SOMENTE BASEADA EM CRITÉRIOS
  FISIOLÓGICOS
• - CRITÉRIOS FENOTÍPICOS E GENOTÍPICOS -
  COMBINAÇÃO

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• DEFINIÇÃO
• Os métodos fenotípicos são aqueles que
  caracterizam os produtos da expressão gênica para
  a diferenciação das cepas.
• - Em decorrência deles envolverem a expressão do
  gene, estas propriedades podem variar, baseado em
  mudanças das condições de crescimento, fase de
  crescimento e mutações espontâneas.

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• CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO FENOTÍPICA -
  MÉTODOS TRADICIONAIS
• DESVANTAGENS
• Procedimentos podem ser longos
• Ambíguos
• Afetados pelas condições do meio
• Espécies filogeneticamente distintas
• Problemas técnicos que dificultam a interpretação
  dos resultados (crescimento não é suficiente para
  degradar o substrato que se está testando,
  algumas características são instáveis meios de
  cultura utilizado)
• Culturas mistas não permitem a diferenciação de
  espécies

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CARACTERES FENOTÍPICOS MAIS UTILIZADOS
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1-Características morfológicas das
colônias 2-Forma, Coloração de Gram, Arranjo,
Motilidade, Catalase 3-Modo de fermentação da
glicose (carboidratos) e perfil
bioquímico 4-Fatores de crescimento 5-Disponibil
idade de oxigênio 6-Testes de produção de
gás 7-Tolerância ao sal, pH e bile 8-Crescimento
em determinadas temperaturas (máxima e
mínima) 9-Condições do ácido láctico produzido
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10-Tipos de bacteriófagos 11-Hidrólise da
Arginina 12-Formação de Acetoina
(Acetilmetilcarbinol) 13-Fermentação
butilenoglicólica 14-Tipo de hemólise 15-Produçã
o de polissacarídeos extracelulares 16-Tipagem
sorológica 17-Presença de enzimas e antígenos na
superfície celular 18-Perfil eletroforético de
proteínas 19-Atividade antimicrobiana 20-Lipídeo
s e constituintes da parede celular
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Características morfológicas das colônias
VRB GLUCOSE AGAR 1-Esch. Coli2-Staph.
aureusEncubação 24hs em 35ºC
TCBS CHOLERA MEDIUM 1-V. Cholerae2-Esch.
ColiEncubação 24hs em 35ºC
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• Plaqueamento
• (meios seletivos, diferenciais)
• Meios seletivos (antibióticos, ingredientes e
  suplementos)
• Meios diferenciais (características morfológicas
  das colônias)
• Características das colônias nestes meios
  (tamanho, forma, brilho, cor, viragem de meio,
• presença de halo e pontos centrais, borda, tempo
  de incubação)

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(No Transcript)
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Figure 1 Single cell sort ( Nebe-von Caron et
al., 2000) of Salmonella culture results in
different colony morphology.
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Forma, coloração de Gram, Arranjo, Motilidade,
Catalase
Figure 2 Surface detail of Salmonella cells
obtained by atomic force microscopy
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(No Transcript)
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3-Modo de fermentação da glicose (carboidratos)
Tube 1Culture en WW (rose) Tube 2Lait Tube
3Type respiratoire anaerobi (WW profond) Tube
4Glucose Tube 5Saccharose Tube 6Lactose
Tube 7Glycerol Tube 8Mannitol Tube 9Amidon
Tube 10Indole Tube 11Nitrate
Bifidobacterium
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(No Transcript)
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Bacterial culture showing zones of inhibition
around various antibiotic disks
Coloração de Cryptococcus neoformans com Tinta da
India. Destaca-se a cápsula de natureza
polissacarídica. Variações no polissacarídeo
majoritário da cápsula levam à classificação em
diferentes sorotipos e variedades dessa espécie,
as quais podem ser diferenciadas por métodos
bioquímicos e genéticos.
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• Eletroforese de proteínas
• Transaldolase
• Fosfogluconato desidrogenase
• Proteínas totais
• Lactato desidrogenase

Composição da parede celular
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CARACTERES GENOTÍPICOS MAIS UTILIZADOS
DNA/RNA
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• DEFINIÇÃO
• MÉTODOS GENOTÍPICOS IDENTIFICAM ATRAVÉS DO
  GENOMA, AO CONTRÁRIO DOS MÉTODOS BIOLÓGICOS E
  IMUNOLÓGICOS (FENOTÍPICOS) QUE DETECTAM OS
  PRODUTOS CODIFICADOS PELO GENOMA.
• Ácidos nucléicos são universais em biologia
  celular, e a seqüência de bases de nucleotídeos
  das moléculas não são influenciadas pelas
  condições de cultivo. Análises dos ácidos
  nucléicos deste modo, provem a base dos métodos
  de identificação e possuem a vantagem da
  reprodutibilidade. Métodos genéticos são mais
  promissores para uma rápida e acurada
  identificação.

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Métodos capazes - Relação FILOGENÉTICAS
- Hibridização DNA-DNA - Seqüenciamento do gene
codificador do rRNA 16S - Seqüenciamento da
região espaçadora ITS (Internal Transcribed
Space) entre os genes do operon que codificam o
rRNA.

• Permitem detectar diferenças e similaridades
  entre amostras bacterianas da mesma espécie, e
  conseqüentemente, verificar se amostras isoladas
  de diferentes pacientes ou locais possuem uma
  origem comum.

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• Sondas genéticas (PROBE)
• Segmentos específicos de DNA ou RNA (fita
  simples) que reconhecem e anelam (hibridizam) com
  seqüências complementares (pareamento de bases
  complementares) formando moléculas híbridas de
  fita dupla.
• As sondas são marcadas (radioisótopos, enzimas ou
  moléculas quimioluminescentes)
• As amostras em teste são inoculadas sobre um
  suporte sólido (filtro nitrocelulose) colocado na
  superfície de um meio de cultura sólido.

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- As colônias desenvolvidas sobre o filtro são
submetidas a um tratamento (lise), expondo e
desnaturando seu genoma - Para os testes de
hibridização, os filtros são incubados com uma
solução contendo a sonda marcada. Onde for
homólogo ela hibridiza e é detectada (cor ou
luz) - Praticamente todos os microrganismos
contêm alguma seqüência nucleotídica exclusiva
que pode ser usada como sonda (sondas podem ser
gênero, espécie ou mesmo amostra específica).
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• PCR (REAÇÃO DE POLIMERASE EM CADEIA)
• - Permite a detecção de microrganismos isolados
  ou diretamente em material clínico, mesmo se
  presente em pequenas quantidades
• Amplificação de seqüências nucleotídicas
  específicas (segmento alvo)
• Amplificação processo de síntese de DNA
  dirigida (desnaturação, ligação de primers
  -seqüências pequenas presentes nas extremidades
  que ladeiam o segmento-alvo e a extensão dos
  primers, através da DNA polimerase, para produzir
  cópias idênticas do segmento-alvo.
• -Seqüência entre os dois primers é amplificada

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RESTRICTION FRAGMENTE LENGHT POLYMORFISM RFLP -
Polimorfismo observado no tamanho dos fragmentos
resultantes da restrição enzimática

• As bactérias apresentam em seu cromossomo regiões
  que tendem a variar de amostra para amostra,
  dentro de uma mesma espécie bacteriana, embora
  essas regiões sejam constantes dentro de uma
  mesma amostra.
• Quando o cromossomo é purificado e clivado com
  endonucleases de restrição, em numerosos
  fragmentos de fita dupla, essa variabilidade pode
  ser observada.

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• Os fragmentos devem ser separados em gel
  (poliacrilamida ou agarose).
• Ao se comparar o DNA de duas amostras por esse
  método, é freqüentemente possível distinguir
  diferenças no padrão de bandeamento (devido as
  diferenças no tamanho dos fragmentos).
• As diferenças podem ser sutis, e as vezes, para
  melhor visualização podemos escolher sondas que
  hibridizam especialmente com regiões altamente
  variáveis. Após a hibridização, as diferenças na
  localização e no tamanho dos fragmentos são
  acentuadas e facilmente identificadas.

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ETAPAS - RFLP
1 Isolamento do DNA cromossômico 2 Digestão
com enzima (s) de restrição 3 Eletroforese em
Gel de Campo Pulsante PFGE
(Pulsed Fied Gel Electrophoferis) 4 Coloração
com Brometo de Etídio 5 Fotografia do perfil
obtido.
Banda escolhida ou probe
Digestão com Eco R1
Ação - E. R.
Purificação
Digestão com Hind ll
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(No Transcript)
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PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS - PFGE

• Eletroforese em gel de agarose mais utilizado
• Entretanto este método não permite uma resolução
  eficiente de fragmentos de DNA maiores do que
  40Kb
• -Estes fragmentos são tão grandes que acabam
  apresentando uma mesma taxa de migração no campo
  elétrico
• PFGE as moléculas são submetidas a campos
  elétricos aplicados alternadamente em duas
  direções da mesma forma de RFLP, o DNA é
  purificado e clivado com enzimas de restrição, só
  que, no caso da PFGE, as enzimas utilizadas
  cortam o DNA em número menor de fragmentos e,
  portanto, maiores em tamanho.

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• PCR Polimerase Chain Reaction

• Polimerase termoestável
• Deoxinucleotídeos (dNTP)
• Dois iniciadores (primers)

Etapas

• Separação das hélices do DNA a ser amplificado
• Ligação complementar entre os primers e o DNA
• Síntese do DNA pela Taq polimerase.

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• Multiplex-PCR
• - A técnica de PCR na sua forma mais simples
• - Amplifica regiões específicas do DNA
• - Utiliza um conjunto de iniciadores diferentes
• - Mais regiões amplificadas mais confiável é a
  técnica
• - Conhecimento prévio das seqüências (ou seja, do
  gene/
• região de interesse).

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• RAPD PCR (Random Amplified Polymorphic DNA)
• ou AP-PCR (Arbitrary Primed Polimerase Chain
  Reaction)

• Não requer um conhecimento dos fragmentos do
  genoma
• Usa-se um único iniciador arbitrário
• Amplifica as seqüências com maior homologia
• Pode-se adequar as condições da reação
• Intervalo entre as regiões é amplificado
  (orientação dos
• primers síntese ocorre na região interna
  entre eles)

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• Triplet RAPD-PCR ou TAP-PCR

• Contorna o problema de reprodutibilidade do
  RAPD-PCR
• Temperaturas de hibridização (38 40 e 42ºC)
• Bandas presentes em pelo menos dois perfis são
• consideradas flexíveis
• Discriminatória ao nível de espécie e cepas
  dentro de uma
• mesma espécie
• Limite de confiança é ampliado.