La fluorescence

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La fluorescence

• Application à la biologie

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La fluorescence

1. Principe de la fluorescence
2. Microscopie à épifluorescence

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Généralités

• Les fluorophores sont avant tout des chromophores
• Les chromophores sont des constituants
  moléculaires qui absorbent la lumière hc/?1,
• Ce sont en général des composés aromatiques.
• Excités,les fluorophores peuvent, eux, émettre de
  la lumière à une longueur donde différente hc/?2

4n2 e-
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Quest-ce quune molécule fluorescente ?
La fluorescence est caractérisée par des
transitions électroniques entre un état singulet
fondamental et l'état singulet excité. La durée
de vie moyenne de l'état excité est de l'ordre de
10-9 à 10-7 s
GFP t 2,1 ns
Perte dénergie
Émission de fluorescence, de plus faible
énergie (plus grande longueur donde)
Photon (lumière d'excitation)
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Diagramme de Jablonski (simplifié)
S1
T1
ABS
FL
Relax th
ENERGIE
Photoblanchiement
Phosp
S0
Eexc Eem chaleur (Eexc gt Eem) E (hc)/ l
?exc lt ?em
?
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Les molécules fluorescentes utiles en biologie

• Des protéines
• De petites molécules aromatiques
• Des nanocristaux de semiconducteurs

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GFP
Absorption
Rendement Q
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Représentation dune protéine fluorescente
tétramérique (asFP595)
Chromophore (GFP) -S-Y-G-
Maturation post-traductionnelle du fluorophore de
la GFP
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Les marquages en immunofluorescence
fluorochrome
Anticorps secondaire
Anticorps primaire
Antigène
Echantillon
Coupe semi-fine
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(No Transcript)
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Représentation dun fluorophore inorganique
(Alexa 568)
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Exemple de quadruple marquage
ex em
400 500 600
700 nm
UV
IR
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Photoblanchiment (photobleaching, fading)
Alexa 488
Oregon Green 514
Fluorescence ( valeur initiale)
BODIPY
Oregon Green 488
Fluorescein
Temps (secondes)
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Spectre continu
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Trajet optique Microscope droit
Observation en lumière transmise
Observation en fluorescence avec un jeu de filtre
spécifique de la GFP
Observation en fluorescence avec un jeu de filtre
spécifique de lAlexa 568.
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Exemple dimage en épifluorescence (dendrites de
neurone P-GFP)
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Cest tout et cest déjà pas mal !!!!
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Principaux fluorochromes utilisés en
microscopie en épifluorescence et confocale
- immunofluorescence FITC, TRITC, lissamine
rhodamine, Texas Red, Cy3, Cy5, Alexa Fluors -
ADN iodure de propidium, YOYO, Syto16,
chromomycine A3, mithramycine DAPI, Hoechst,
DRAQ5, TOTO3 - mitochondie sensible au
potentiel membranaire Rhodamine 123, DiOC6(3),
DiOC7(3), JC-1, MitoTracker Red CMXRos
(post-fixation possible) - membranes FM1-43,
FM4-64, fusions-GFP, divers anticorps de
surface - Viabilité FDA, exclusion diodure de
propidium, morphologie, avec DIC
- réticulum endoplasmique (non spécifique)
DiOC6(5), GFP-taggée - appareil de Golgi
GFP-taggée, anticorps, NBD-C6-ceramide (pas pour
végétaux) - dépendance envers le pH
carboxy-SNARF-1, BCECF - dépendance envers le
calcium Fluo-3 ou -4 ( FF), FuraRed,
CalciGreen, Indo-1, Cameleon - divers Acridine
Orange, Neutral Red, Lucifer Yellow,
chlorophylle, - Protéines Autofluorescentes
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Quelques documents

• Wikipedia http//fr.wikipedia.org/wiki/Fluorescenc
  e
• Live Cell Imaging (GoldmanSpector, Cell Press)
• Invitation à la fluorescence moléculaire (Valeur,
  De Boeck)
• Cell Imaging Techniques (Mossman, Brooke,
  Taatjes, Douglas, Humanan Press)
• Fluorescence microscopy (Rost , Fre, Cambridge
  University Press)

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Bonus

• GFP photoactivable, photoconversion
• Quantum dots

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Les paramètres caractéristiques dun fluorophore
http//fr.wikipedia.org/wiki/Fluorescence

• Spectre dabsorption capacité à absorber la
  lumière (chromophore) caractérisé par son
  maximum
• Spectre démission capacité à émettre de la
  lumière après excitation caractérisé par son
  maximum
• Décalage de Stokes mesure lécartement des
  deux spectres précédents, en général on
  préfère les fluorophores ayant un grand
   Stokes shift 
• Coefficient d'extinction molaire e il mesure
  la quantité de lumière absorbée par mole de
  fluorophore (excitabilité) (? donné)
• Rendement quantique F probabilité quun
  fluorophore excité émette un photon
  (efficacité de fluorescence) 0ltFlt1
• Brillance proportionnelle à la quantité de
  lumière émise par fluorescence à une lumière
  dexcitation donnée. B e x F
• Cinétique de photoblanchiment sensibilité du
  fluorophore
• Durée de vie à létat excité (pour certaines
  applications)

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Photo-activation exemple PA-GFP
Ando, Ryoko et al. (2002) PNAS. 99, 12651-12656
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Quantum dot particule fluorescente non
aromatique !!!
Core nanocrystals with size between 3-8
nm (CdSe, CdTe, CdS, ZnSe)
anorganic shell (ZnS, CdS)
organic shell (silica/siloxane, phospholipides,
proteins)
10 - 15 nm
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Ordre de grandeur - Q-dot
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Propriétés
Brillance e.FF
eGFP 33 000
Q Dot 1 000 000

• Forte brillance
• Résistance au photoblanchiement
• Clignotement
• Large gamme de spectre accessible en excitant
  dans le domaine UV

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Exemple dapplication suivi de molécules
uniques
1 µm