Enzimas de restriccin y electroforesis

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Enzimas de restricción y electroforesis
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Enzimas de restricción

• Son endonucleasas específicas capaces de
  reconocer secuencias palindrómicas de DNA y
  cortar los enlaces fosfodiéster del material
  genético en un punto específico.
• Palindrómicas quiere decir que leen en
  direcciones opuestas el mismo orden de
  nucleótidos.
• 5 G T T A A C 3
• 3 C A A T T G 5

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Tipos de endonucleasas

• Endonucleasa Tipo I corta lejos de la sucuencia
  que reconoce, ya sea río arriba o río abajo.
• Endonucleasa Tipo II cortan dentro de la
  secuencia que reconocen.
• Endonucleasa Tipo III cortan de 5-8 bases antes
  o después de la secuencia que reconocen.

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Enzimas de restricción

• Son suceptibles a cambios en temperatura, pH,
  etc.
• Estas enzimas se obtienen de células bacterianas.
• El nombre de estas está dado según el género y la
  especie de la bacteria de dónde se aisló por
  primera vez esta enzima.
• La primera letra representa el género de la
  bacteria, las próximas dos indican la especie, la
  cuarta letra indica la cepa y el número al final
  indica el número de enzima que se ha aislado de
  esa cepa.

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Enzimas de restricción

• Por ejemplo
• EcoRI
• Otros ejemplos
• BamHI la primera que se aisló de la cepa H de
  Bacillus amyloliquefaciens
• SmaI la primera que se aisló de Serratia
  marcesens
• HindIII la tercera que se aisló de la cepa d de
  Haemophilus influenzae

Primera enzima aislada de ese organismo.
Escherichia (género)
coli (especie)
cepa R
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Tipos de corte

• Sticky o pegajosos es más fácil para volver a
  ligarse los extremos.
• Ejms.
• EcoRI
• Bam HI
• HindIII
• Blunt o abruptos
• Ejm.
• SmaI

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Enzimas de restricción

• Las endonucleasas son de gran importancia para la
  ingeniería genética, ya que permiten desarrollar
  técnicas de clonación.
• Además, te permite realizar mapas de restricción
  y determinar si existe homología entre otras
  moléculas de DNA.

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Electroforesis

• Se define como el movimiento de partículas de
  carga bajo la influencia de un campo eléctrico a
  través de un medio semisólido.
• Este medio puede ser de agarosa o de
  poliacrilamida.

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Electroforesis

• El DNA es de carga negativa, por lo que las
  partículas migran del electrodo negativo (cátodo)
  al electrodo positivo (ánodo).
• Esta migración es inversamente proporcional al
  peso molecular de las muestras.

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Electroforesis

• Materiales necesarios para llevar a cabo una
  electroforesis
• Gel de agarosa generalmente se utiliza de 1 -
  2 de agarosa.
• Cámara de electroforesis contiene los
  electrodos
• Power supply genera el campo eléctrico

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Electroforesis

• Amortiguador de electroforesis - usualmente TBE
  1X facilita la migración de DNA y mantiene una
  estabilidad
• Bromuro de etidio compuesto carcinógeno que se
  entrecruza entre las moléculas de DNA y cuando se
  irradia con luz ultravioleta emite fluorescencia.

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Electroforesis

• Loading dye compuesto que se añade a las
  muestras de DNA contiene glicerol, que le da
  peso a la muestra y no permite que se salgan de
  la fosa, y bromofenol azul que tiñe la muestra de
  color azul y sirve como indicador de migración
• Lámpara de UV permite ver las bandas generadas
• Cámara para tomar una foto de la gel

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(No Transcript)
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Electroforesis